microRNA在骨髓间质干细胞介导的急性肾损伤修复中的作用研究

摘要

目的：探讨大鼠骨髓间质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，rMSCs)在顺铂诱导的大鼠急性肾损伤(acutekidneyinjury，AKI)中通过调控关键microRNA(miRNA)的表达从而发挥修复作用。骨髓间质干细胞(rMSCs)移植AKI大鼠，观察rMSCs对损伤肾的修复作用;miRNA芯片比较筛选出在rMSCs组与PBS组中表达差异的miRNAs分子，体内外实验验证并探寻rMSCs修复肾损伤中的关键miRNAs，揭示rMSCs修复肾损伤的可能分子机制。
　　 方法：以6mg/kg剂量的顺铂经腹腔注射到大鼠体内，建立急性肾损伤实验动物模型。于顺铂注射后的24h以尾静脉注射方式将2×106rMSCs输注到大鼠体内，并分别在损伤不同时间点收集大鼠的血液，检测血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平来评价MSC对肾功能的改善情况，通过活体成像观察rMSCs的组织定位。于顺铂注射后5d处死大鼠，留取肾组织标本，HE染色观察rMSCs对肾组织的修复作用，WesternBlot检测凋亡相关蛋白的表达，免疫组织化学染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，TUNEL染色检测肾小管上皮细胞的凋亡情况，综合评价间质干细胞对急性肾损伤的修复作用。在此基础上，留取正常大鼠（对照组），急性肾损伤输注PBS大鼠（PBS组）以及输注rMSCs的大鼠（rMSCs组）的肾组织进行microRNA芯片分析。经芯片比较筛选，选取rMSCs组与PBS组差异显著的miRNAs分子，经qRT-PCR检测并验证这些miRNAs分子在体内外模型中的表达情况。在体内外模型中差异变化一致的miRNAs，进一步研究其下游靶基因及相关信号通路，探讨rMSCs修复肾损伤中可能的分子机制。
　　 结果：体内活体成像结果显示经尾静脉注射的rMSCs能够到达损伤的大鼠肾组织，rMSCs移植组的BUN、Cr水平较PBS组有明显的下降(P＜0.05)，病理HE染色结果显示rMSCs移植组的肾组织结构比较完整、蛋白管型减少，免疫组织化学与TUNEL染色结果揭示rMSCs能显著增加损伤部位的肾小管上皮细胞的增殖，减少肾小管上皮细胞的凋亡，WesternBlot显示rMSCs移植组的Bax表达下调，Bc1-2的表达上调。microRNA芯片分析显示部分miRNAs分子在PBS组较正常对照组的表达显著增高或降低，而rMSCs可以逆转相应miRNAs分子的表达。选取miR-92b，miR-146b，miR-150*与miR-455进行验证，qRT-PCR验证结果显示miR-146b在体内外模型中变化一致且与芯片结果相符，初步选取miR-146b进行体外功能实验。WesternBlot进一步检测了miR-146b的靶基因表皮生长因子受体(EGFR)在各组中的表达，结果显示在PBS组由于miR-146b高表达，EGFR的表达较低，而rMSCs降低了miR-146b的表达，导致EGFR蛋白表达增加，从而调控其下游Akt相关蛋白通路，在肾损伤中发挥修复作用。
　　 结论：rMSCs的移植对急性肾损伤具有修复作用，该治疗作用的机制可能是间质干细胞通过对miRNAs的调控而发挥组织损伤修复功能。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 间质干细胞

1．1．1 间质干细胞的生物学特性

1．1．2 间质干细胞的应用

1．1．3 骨髓间质干细胞与肾损伤

1．2 microRNA

1．2．1 microRNA定义及功能

1．2．2 microRNA与疾病

1．3 间质干细胞与microRNA

第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义

2．1 研究目的

2．2 研究方法

2．3 实验设计方案

2．3．1 技术路线1

2．3．2 技术路线2

2．3．3 技术路线3

2．4 研究意义

第三章 大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及鉴定

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 主要材料、试剂

3．1．2 主要仪器、耗材

3．2 方法

3．2．1 大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)分离

3．2．2 rMSCs的培养

3．2．3 流式细胞仪检测rMSCs的表面标记

3．2．4 rMSCs的成骨与成脂诱导

3．3 结果

3．3．1 rMSCs的形态

3．3．2 流式细胞术检测rMSCs的表面标记

3．3．3 rMSCs的成骨、成脂诱导

3．4 讨论

第四章 顺铂诱导的急性肾损伤大鼠模型的建立

4．1 实验材料与仪器

4．1．1 主要材料、试剂

4．1．2 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 大鼠急性肾损伤模型的建立

4．2．2 rMSCs的体内示踪

4．2．3 rMSCs的移植

4．2．4 标本处理

4．2．5 石蜡切片的制作及HE染色

4．2．6 TUNEL

4．2．7 免疫组织化学染色

4．2．8 Western Blot

4．2．9 数据处理与统计

4．3 结果

4．3．1 CM-Dil标记的大鼠骨髓MSCs的体内示踪

4．3．2 大鼠骨髓MSCs改善肾功能

4．3．3 大鼠骨髓MSCs促进肾组织的修复

4．3．4 大鼠骨髓MSCs减少肾小管上皮细胞的凋亡

4．3．5 大鼠骨髓MSCs促进肾小管上皮细胞的增殖

4．4 讨论

第五章 microRNA芯片筛选及分析

5．1 实验材料与仪器

5．1．1 主要材料、试剂

5．1．2 主要仪器、耗材

5．2 方法

5．2．1 microRNA芯片肾脏标本收集

5．2．2 microRNA芯片检测

5．2．3 体外实验(Transwell共培养)

5．2．4 总RNA提取

5．2．5 逆转录反应

5．2．6 荧光定量RT-PCR

5．2．7 Western Blot

5．2．8 数据处理与统计

5．3 结果

5．3．1 差异microRNA芯片结果

5．3．2 差异miRNAs的验证

5．3．3 Western Blot

5．4 讨论

结论及展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文与参加的会议