白蚁菌圃及中药等对神经系统退行性疾病治疗机制及效果的研究

摘要

背景和目的：
　　神经系统退行性疾病，是一组由慢性进行性中枢神经组织退行性变性而产生的疾病总称，它包括:阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、亨廷顿病(Huntington disease，HD)、帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)、多发性硬化(multiple sclerosis，MS)等。迄今为止，此类疾病的发病病因及发病机制尚未完全阐明，随着老龄化社会的来临，神经系统退行性疾病中AD和PD患病率呈逐年上升趋势，虽然其具体发病机制目前尚不能明确，但有研究表明，AD和PD的发生发展有着共同的氧化应激损伤通道，从而造成生物大分子物质氧化损伤，并最终导致细胞凋亡，氧化应激在AD、PD发生发展中起着重要作用。
　　在神经系统退行性疾病治疗方面，传统的药物治疗方法，副作用大，费用高，易产生耐药性，长期服药效果下降，近年来，大量的研究证明，很多中药均有清除自由基的功效，能够抑制氧化应激所带来的一系列的损伤及其继发的细胞凋亡，尤其在治疗AD、PD方面取得了显著的成绩，今后中药在阻止或延缓AD、PD发生、发展，以及预防和治疗AD、PD中会起着一定的积极作用。
　　本研究旨在研究和探讨白蚁菌圃及中药等，其抗氧化、治疗神经系统退行性疾病的机制和效果，为开发新的治疗神经系统退行性疾病的药物提供理论依据。
　　研究方法
　　1.利用N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)给大鼠腹腔注射，再用爬杆法进行筛选，选取PD模型大鼠随机抽取治疗组及对照组，由黄芪、天麻、银杏叶、白芍、钩藤、连翘、生甘草、野生葛根、大叶红景天、黄连等配成中药平颤方，联合褪黑素(MT)给予模型组及对照组进行治疗21d，观察大鼠的行为学及脑切片，分别用H-E染色，Bax/Bcl-2免疫组织化学染色和TUNEL法细胞凋亡染色，对脑匀浆进行多巴胺(dopamine，DA)及高香草酸(homovanillic acid，HVA)和二羟基苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid，DOPAC)的测定。
　　2.利用野生型果蝇(UAS-wild-typeα-synuclein/+)及UAS-DdC果蝇杂交得到PD果蝇，以野生型果蝇为对照组和PD果蝇作为研究组，给予不同浓度的白蚁菌圃醇提液培养42d，并对培养前后PD果蝇的行为学及寿命进行分析、对果蝇脑组织病理切片苏木精-伊红(HE)染色后观察。
　　3.利用D-半乳糖持续皮下注射建立小鼠AD模型的，作为实验组，正常小鼠作为对照组，采用Morris水迷宫定位航行实验，分别从四个象限将小鼠放入水池中，计算潜伏期平均值，以评价小鼠空间记忆的获得能力，并对模型实验组小鼠血液进行过氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)及谷胱甘肽(GSH)的测定，评价造模是否成功，给予模型组小鼠喂食不同浓度的白蚁菌圃醇提液，同时测定AD模型治疗组小鼠血液的SOD，MDA和GSH水平，评价不同浓度白蚁菌圃醇提液对AD小鼠的治疗效果，并分别观察比较AD模型组与治疗组的小鼠脑部β-淀粉样蛋白表达、脑组织和肝组织病理学改变。
　　4.白蚁菌圃醇提液对抗SH-SY5Y细胞氧化应激损伤作用的研究，用H2O2建立人神经瘤母细胞SH-SY5Y氧化应激损伤模型，MTT法测不同时间段的细胞存活率，同时收集各组细胞培养液用于检测SOD、MDA和GSH，在造模同时和造模后加入不同浓度的白蚁菌圃醇提取液，观察其对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的预防及治疗作用。
　　5.白蚁菌圃水提液对胃癌细胞系BGC-823细胞生长的影响，应用白蚁菌圃水提液与BGC-823细胞作用24 h后，于倒置显微镜下观察细胞形态的变化，台盼蓝染色法测细胞存活率，MTT比色法检测细胞活性，取对数期生长的BGC-823细胞，同时设空白对照组，流式细胞仪检测细胞凋亡，并行细胞总RNA的提取，cDNA逆转录，荧光定量PCR，设计引物，扩增。
　　结果
　　1.MPTP复制的PD动物模型，其前脑组织DA、HVA、DOPAC含量与空白对照组相比，均显著降低，同时伴随有智力减退和运动障碍;使用中药平颤方+MT治疗21 d，模型组中DA、HVA、DOPAC含量均较病理对照组明显增加;给予中药平颤方联合MT治疗PD，大鼠前脑纹状体神经元和胶质细胞Bcl-2基因蛋白的表达明显增多、增强，Bax基因表达受到抑制，同时DA细胞凋亡减少。
　　2.与对照组相比，PD雄性果蝇的攀爬能力随年龄成熟而增强，但在羽化后的24到48 d，下降较明显。在白蚁菌圃实验组中，白蚁菌圃干预并起作用的时间和浓度相关，在雌性果蝇中，PD果蝇的攀爬能力随着年龄的增长而逐渐降低，不同浓度的白蚁菌圃培养都能提高PD果蝇的攀爬能力，在羽化后18到48 d最显著，且随浓度及果蝇年龄的增长，效果更好，雌雄PD果蝇之间攀爬能力无明显差异，且用含不同浓度的白蚁菌圃醇提液培养基饲养的果蝇寿命明显延长，呈现了较好的剂量依赖性关系。取攀爬能力下降较明显的第36 d的果蝇，制作病理切片，经HE染色的病理切片可见，与对照组相比，PD果蝇的脑组织边缘皮质层细胞变薄、排列紊乱，空泡增多，添食了白蚁菌圃提取物的果蝇脑组织中，细胞数目增多，排列较紧密有序，空泡减少。
　　3.在AD衰老模型组迷宫试验中，小鼠体力、智力下降，逃避潜伏期延长明显，其氧化和抗氧化指标明显改变，且AD模型组脑部改变与衰老的生理变化相符合，与相关文献报道一致，证明造模成功。治疗组中，小鼠血液SOD活力、GSH含量、MDA含量较模型组有明显改善，不同浓度白蚁菌圃治疗后AD模型组脑细胞、肝细胞中，细胞形态随着药物治疗浓度的增加，绝大多数细胞形态逐渐接近正常，且治疗组脑组织绝大多数细胞中，β-淀粉样蛋白表达逐渐接近正常组小鼠脑组织。
　　4.在神经瘤母细胞SH-SY5Y细胞的培养液中加入不同剂量的白蚁菌圃醇提液，通过SOD、MDA及GSH测定结果表明，白蚁菌圃醇提液预先处理细胞，可以对抗H2O2诱导的SH-SY5Y细胞的损伤，存活率提高，表明白蚁菌圃醇提取液可以对抗H2O2造成的损伤。
　　5.白蚁菌圃水提液与胃癌细胞系BGC-823细胞作用24 h后，结果显示，加药后BGC-823细胞的生长受到抑制，细胞的数量和形态都发生了改变，细胞数目减少，部分细胞破裂，另有部分细胞的核皱缩，核浆变少等，表明白蚁菌圃水提液能破坏和抑制BGC-823细胞的生长，对BGC-823细胞的存活率有较大影响，细胞的存活率与浓度呈负性相关，同时发现白蚁菌圃提取物可以引起p53基因表达的上调，但其机理有待研究。
　　结论
　　1.MPTP注射建模显示，模型组绝大多数小鼠鼠须脱落明显，毛色逐渐失去光泽，易脱落，皮肤弹性差，呈现出衰老体征，表明AD模型成功建立，中药副作用小，可以和西药配伍，从而增加治疗的效果减少耐药性，模型实验组中药治疗后，衰老症状、行为学及脑部组织病变等均有改善，褪黑激素分子小，作用部位广泛，以其高弥散的穿透能力发挥生物学效应，通过提高脑的抗氧化能力，防止脑组织免受自身氧化应激损伤。中西药二者联合使用，有机联系辨证论治的统一性和证候之间的关系，为探索中医或中西医结合治疗PD的优势及其作用机制提供了理论基础。
　　2.果蝇具有高度发达的神经系统、较短的生命周期，并且易于进行细胞生物学、遗传学、分子生物学研究的操作和分析，是一个非常稳定而实用的模式生物，果蝇PD模型能够很好的模拟人类PD的慢性退行性改变。白蚁菌圃对PD果蝇的攀爬能力及寿命有较明显的改善，且呈现较好的浓度和时间依赖性，雌性和雄性之间无明显差异，经白蚁菌圃治疗后的PD果蝇，其脑组织边缘皮质层细胞较PD模型组增多，且排列整齐，脑组织内的空泡减少，此改变与果蝇的攀爬能力和寿命的改变相一致，由此可以证明白蚁菌圃可以改善PD的运动障碍，可能与白蚁菌圃抗氧化作用相关，其神经保护作用及抗PD的作用机制，仍需进一步研究，因其较强的抗氧化作用，白蚁菌圃有望发展成为一种预防和治疗PD的新型药物。
　　3.在实验中，利用D-半乳糖持续皮下注射建立小鼠AD模型可靠，经不同浓度白蚁菌圃治疗后，氧化抗氧化指标及肝组织、脑组织形态改变、脑组织中β-淀粉样蛋白表达减少，随着治疗浓度的增加，改变呈现浓度依赖性，显示高浓度治疗剂量效果更佳，说明白蚁菌圃具有抗AD的作用。
　　4.以H2O2体外诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的模型，可以比较直观地分析抗氧化剂对细胞的保护作用，预先加入白蚁菌圃醇提取液处理细胞，说明白蚁菌圃醇提取液具有一定的预防H2O2对SH-SY5Y细胞的损伤作用。当白蚁菌圃醇提取液与H2O2同时处理细胞时，细胞的存活率比H2O2损伤对照组仍有提高，并与剂量呈正向趋势，说明在白蚁菌圃醇提取液中存在抗氧化的物质，推论白蚁菌圃具有抗氧化的作用，可能与其高含量的黄酮总甙有关，但其起作用的主要成分尚不清楚，需进一步检测。
　　5.实验研究结果表明，白蚁菌圃对胃癌细胞BGC-823具有一定的促凋亡作用，但具体机制尚不清楚，有待深入研究。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1 研究背景

1．1 神经系统退行性疾病的模型研究

1．2 中药及白蚁菌圃的治疗作用

2 研究的目的和意义

3 研究方法

4 实验思路

4．1 中药对PD模型大鼠的治疗作用的研究

4．2 白蚁菌圃对PD果蝇治疗作用以及抗肿瘤作用的研究

4．3 白蚁菌圃对AD模型小鼠治疗作用的研究

参考文献

第二章 一般材料与方法

1 试剂配制

2 试验方法

2．1 细胞培养

2．2 细胞传代

2．3 细胞计数

2．4 细胞冻存

2．5 细胞复苏

2．6 HE染色

2．7 TUNEL(DNA断端末端标记)实验

2．8 MTT实验

2．9 流式细胞仪分析

2．10 细胞的原位杂交

2．11 免疫组化

2．12 细胞总RNA的提取

2．13 Real-time PCR扩增

2．14 DA、HVA、DOPAC含量的测定

第三章 中药平颤方联合MT对PD模型大鼠前脑细胞凋亡的作用

1 材料与方法

1．1 动物分组及建模

1．2 爬杆实验和迷宫实验

1．3 中药配方及治疗

1．4 取材和切片制备

1．5 Bax／Bcl-2免疫组织化学染色

1．6 TUNEL法细胞凋亡染色

1．7 DA、HVA、DOPAC含量的测定

1．8 统计学分析

2 结果

2．1 治疗对PD大鼠行为的影响

2．2 治疗对PD大鼠智力状况的影响

2．3 治疗对PD大鼠前脑细胞的影响

2．4 治疗对PD大鼠前脑DA及其代谢物质含量的影响

3 讨论

参考文献

第四章 白蚁菌圃提取物对PD果蝇的行为学和寿命的影响分析

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 白蚁菌圃醇提取液的制备

1．3 果蝇培养

1．4 果蝇的攀爬能力和寿命学分析

1．5 白蚁菌圃对PD果蝇模型治疗作用

1．6 果蝇脑组织病理切片苏木精-伊红(HE)染色

1．7 统计方法

2 结果

2．1 果蝇的攀爬能力

2．2 果蝇的寿命

2．3 果蝇脑组织淀粉样物质的改变

3 讨论

参考文献

第五章 白蚁茵圃提取物对小鼠AD模型的影响

1 D-半乳糖持续皮下注射小鼠AD模型的建立

1．1 材料与方法

1．2 结果与分析

1．3 讨论

2 白蚁菌圃醇提物对AD模型小鼠的治疗作用

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

参考文献

第六章 白蚁茵圃醇提液对抗SH-SY5Y细胞氧化应激损伤作用的研究

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法和实验步骤

1．3 MTT比色法检测细胞活力

1．4 SOD、MDA及GSH测定

1．5 统计学处理

2 结果

2．1 白蚁菌圃醇提液对SH-SY5Y细胞的保护作用

2．2 SOD、MDA及GSH测定结果

3 讨论

参考文献

第七章 拓展研究 白蚁菌圃提取物对肿瘤细胞生长的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 胃癌细胞BGC-823形态学改变

2．2 对细胞存活率的影响

2．3 白蚁菌圃水提液对细胞增殖的影响

2．4 白蚁菌圃对细胞凋亡的影响

2．5 对p53表达的影响

3 讨论

参考文献

第八章 主要结论及展望

1 主要结论

2 创新性

3 展望

第九章 文献综述(一)

第十章 文献综述(二)

缩写与符号

致谢

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