microRNA-200c在结直肠癌细胞中对5-FU化学敏感性的影响及其机制的研究

摘要

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一。在世界范围内其发病率位居恶性肿瘤发病率的第三位，死亡率位居癌症相关死亡率的第五位，成为危害人民健康的主要因素。肿瘤在化疗治疗中，耐药现象已成为影响肿瘤患者生存率和复发的严重问题。提高肿瘤对于化疗药物的敏感性成为结直肠癌研究的热点。
　　microRNA-200c(miR-200c)属于miR-200家族。研究报道，miR-200c在结直肠癌组织与正常的癌旁组织相比存在异常表达，并且与结直肠癌的生长、增殖、侵袭、转移密切相关，甚至于在结直肠癌的耐药中也发挥着重要作用。
　　基于5-氟尿嘧啶(5-fluoronracil，5-FU)化疗，半个世纪以来，一直是晚期CRC患者的主要治疗手段。患者对5-FU的反应率仍然不高，主要是因为耐药的产生。因此，我们拟阐明miR-200c对CRC化疗敏感性的影响。
　　目的:探讨结直肠癌细胞株中，miR-200c表达水平对5-FU化学敏感性的影响及其可能的作用机制。
　　方法:
　　1实时荧光定量PCR检测SW620、SW480、HCT116、HT29、HCT8细胞中内源性miR-200c的表达水平;
　　2 Target Scan和miRBase数据库查找miR-200c可能的与耐药相关的下游靶基因;
　　3分别将miR-200c类似物或抑制物及其相应的阴性对照物转染结肠癌SW620细胞、HCT116细胞。转染24h后，再分别加入1000μg/mL与568μg/mL的5-FU作用24 h，MTS及流式细胞术分别检测并计算转染后5-FU的半数抑制浓度(half inhibition concentration，IC50)的变化及细胞凋亡的改变;结肠癌SW620细胞转染miR-200c类似物、抑制物及其相应的阴性对照物48h后，再加入1000μg/mL的5-FU作用8h，Western blotting检测转染后细胞中PTEN(phosphataseand tensin homology deleted on chromosome ten)、p-Akt(phosoho-Akt，磷酸化Akt)、Akt表达的变化。
　　结果:
　　1 miR-200c在5株细胞株中表达水平不同，在SW620、HCT116细胞中的表达水平相对居于中位;
　　2 PTEN、PPP2CA（protein phosphatase2A，蛋白质磷酸酶2A）、PPP2R1B（protein phosphatase2 regulatory subunit A beta，蛋白质磷酸酶2调节亚基1B）、SOCS6(suppressor ofcytokine signaling6，细胞因子信号抑制因子6)、A20(TNFAIP3)（tumor necrosis factor alpha-induced protein3，肿瘤坏死因子α诱导蛋白3）为miR-200c可能直接调控的靶基因并且与耐药密切相关;
　　3 miR-200c类似物组对5-FU的IC50显著高于相应阴性对照组(P均＜0.05);相反，miR-200c抑制物组对5-FU的IC50显著低于相应的阴性对照组(P＜0.05)。
　　4 miR-200c类似物组与相应的阴性对照组相比，降低了5-FU促细胞凋亡的作用（P均＜0.05）;相反，miR-200c抑制物组与相应的阴性对照组相比，提高了5-FU促细胞凋亡作用(P＜0.05)。
　　5 miR-200c类似物组PTEN蛋白表达水平显著低于相应的阴性对照组，而p-Akt的表达水平明显升高（P均＜0.05）;相反，miR-200c抑制物组PTEN蛋白的表达水平显著高于相应的阴性对照组，而p-Akt的表达水平明显降低(P均＜0.05)。Akt蛋白表达水平未见明显差异(P＞0.05)。
　　结论:调控miR-200c的表达可以影响结直肠癌细胞株对5-FU的化学敏感性，这个效应与miR-200c负性调控PTEN的表达引起Akt信号途径失活相关。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 结直肠癌的发病情况

1．2 结直肠癌的化疗抵抗性

1．3 miR-200c与肿瘤

1．3．1 miR-200c影响肿瘤发生发展的研究

1．3．2 miR-200c影响肿瘤化疗敏感性的研究

1．3．3 miR-200c在结直肠癌中的研究进展

1．4 本论文研究的目的、内容、意义、实验方案和设计

1．4．1 研究目的

1．4．2 研究内容

1．4．3 研究意义

1．4．4 实验方案和设计

第二章 结直肠癌细胞株内源性miR-200c表达水平

前言

2．1 材料和试剂

2．1．1 主要材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器和设备

2．2 主要方法

2．2．1 细胞

2．2．2 RNA提取

2．2．3 实时荧光定量PCR反应

2．2．4 细胞转染

2．2．5 统计学分析

2．3 实验结果

2．3．1 五株结直肠癌细胞内源性miR-200c的表达水平

2．3．2 miR-200c转染效率及表达水平的变化

2．4 结论

第三章 miR-200c在结直肠癌细胞中对5-FU化学敏感-陛的影响

3．1 材料和试剂

3．1．1 主要材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器和设备

3．2 主要方法

3．2．1 细胞培养

3．2．2 MTS检测细胞的IC50

3．2．3 流式细胞术检测细胞凋亡率

3．2．4 统计学分析

3．3 实验结果

3．3．1 提高miR-200c的表达水平降低5-FU的化疗敏感性

3．3．2 提高miR-200c的表达水平降低结直肠癌细胞的凋亡

3．4 结论

第四章 miR-200c影响结直肠癌细胞对5-FU化学敏感性的机制研究

前言

4．1 材料和试剂

4．1．1 主要材料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器和设备

4．2 主要方法

4．2．1 细胞培养

4．2．2 miR-200c与耐药相关靶基因的预测

4．2．3 Western blotting检测相关蛋白的表达

4．2．4 统计学分析

4．3 实验结果

4．3．1 miR-200c靶基因的预测

4．3．2 miR-200c对PTEN、p-Akt、Akt蛋白表达的影响

4．4 结论

第五章 讨论

第六章 综述 miRNAs在结直肠癌中的研究进展

第七章 主要结论与展望

7．1 主要结论

7．2 展望

参考文献

英文缩写索引

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章与参加学术会议