人脐带间质干细胞来源exosome在血管形成中的作用及其蛋白质组学分析

摘要

目的:分离鉴定人脐带间质干细胞来源exosome(human umbilicalcord mesenchymal stem cells derived exosome, hucMSC-Ex)，研究hucMSC-Ex在血管形成中的作用，并对hucMSC-Ex进行蛋白质组学分析。
　　方法:采用组织块贴壁法分离培养hucMSC，并通过流式细胞术、成脂和成骨诱导实验鉴定hucMSC;采用蔗糖密度梯度联合超滤超速离心法从hucMSC的无血清培养上清中分离并纯化hucMSC-Ex，透射电镜下观察hucMSC-Ex的形态特征，Nanosight可视型纳米颗粒分析仪检测hucMSC-Ex的直径分布情况，Western-blot检测hucMSC-Ex表面标记CD9和HSP70，SDS-PAGE对hucMSC-Ex的蛋白质组分进行初步分析;将分离纯化的hucMSC-Ex体外作用于人脐静脉内皮细胞EA.hy926，综合运用MTT、细胞计数、划痕实验、Transwell迁移实验、基质胶小管形成实验观察hucMSC-Ex对EA.hy926细胞增殖、迁移和成管能力的影响，并运用Western-blot、免疫荧光、Luminex技术寻找hucMSC-Ex促进血管形成的可能机制;运用LC-MS/MS技术对hucMSC-Ex进行蛋白质组学分析，并通过PANTHER软件对这些蛋白质进行分类和功能富集分析。
　　结果:成功分离得到hucMSC，高表达CD29、CD44、CD90和CD105，不表达CD34和HLA-DR，成脂、成骨诱导试验阳性;成功分离纯化出的hucMSC-Ex为直径在30～100nm左右的圆形或椭网形膜性小囊泡，具有特征性的“杯状”结构，表达exosome表面标记蛋白CD9和HSP70，且蛋白质组分较hucMSC有明显不同，均在55～70KD及170KD～处有富集;hucMSC-Ex在体外能够呈浓度依赖性促进脐静脉内皮细胞EA.hy926的增殖、迁移和小管形成，并活化EA.hy926细胞中的Wnt/β-catenin信号通路;运用LC-MS/MS从hucMSC-Ex中鉴定出499种蛋白质，包括骨架/结构蛋白、钙结合蛋白、细胞外基质/分泌蛋白、分子伴侣、粘附分子、受体、酶调节器、小GTP酶/GTP结合蛋白、激酶、代谢酶（包括水解酶、氧化还原酶、转移酶、合成酶、异构酶等）、核蛋白、转录因子、分拣/运输蛋白、免疫蛋白等，这些蛋白质富含多种生物学功能，参与多种生物学过程，并涉及包括细胞增殖、迁移、粘附和血管形成相关信号通路在内的80种信号通路。
　　结论:采用蔗糖密度梯度联合超滤超速离心法可以成功从hucMSC的无血清培养上清中分离纯化得到exosome; hucMSC-Ex在体外能够通过活化Wnt/β-catenin信号通路促进EA.hy926细胞增殖、迁移和小管形成，提示hucMSC-Ex可以通过促进新生血管形成来达到组织损伤修复的目的;采用LC-MS/MS对hucMSC-Ex进行蛋白质组学分析，成功鉴定出499种蛋白质，为进一步筛选出能有效改善组织损伤的一系列候选蛋白质或蛋白质复合物提供实验基础和理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 人脐带间质干细胞

1．1．1 概述

1．1．2 hucMSC的生物学特性

1．1．3 hucMSC对组织损伤的修复作用

1．2 人脐带间质干细胞分泌的exosome

1．2．1 概述

1．2．2 exosome的生物学特性

1．2．3 exosome的分离及纯化

1．2．4 hucMSC来源的exosome对组织损伤的修复作用

1．3 血管形成

1．3．1 概述

1．3．2 治疗性血管形成

1．4 蛋白质组学

1．4．1 概述

1．4．2 蛋白质组学相关技术

1．5 小结

第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义

2．1 研究目的

2．2 研究方法

2．3 实验设计方案

2．4 研究意义

第三章 人脐带间质干细胞来源exosome的分离鉴定

3．1 材料与仪器

3．1．1 主要材料

3．1．2 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 hucMSC的分离培养

3．2．2 成脂诱导实验

3．2．3 成骨诱导实验

3．2．4 hucMSC无血清条件培养上清(hucMSC-CM)的制备

3．2．5 hucMSC-Ex的分离和纯化

3．2．6 透射电镜观察hucMSC-Ex的形态

3．2．7 Nanosight可视型纳米颗粒分析仪检测hucMSC-Ex的直径分布

3．2．8 SDS-PAGE初步分析hucMSC-Ex的蛋白质组分

3．2．9 Western-blot检测hucMSC-Ex的表面标记蛋白

3．3 结果

3．3．1 hucMSC的形态特征

3．3．2 hucMSC的鉴定

3．3．3 hucMSC-Ex的形态特征

3．3．4 hucMSC-Ex表面标记(CD9、HSP70)的检测

3．3．5 hucMSC-Ex蛋白质组分初步分析

3．4 讨论

第四章 人脐带间干细胞来源exosome对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成能力的影响

4．1 材料与仪器

4．1．1 主要材料

4．1．2 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 细胞培养

4．2．2 hucMSC-Ex的示踪

4．2．3 MTT实验

4．2．4 细胞计数

4．2．5 Transwell细胞迁移实验

4．2．6 划痕实验

4．2．7 基质胶小管形成实验

4．2．8 Western-blot检测细胞增殖、迁移相关蛋白

4．2．9 Luminex技术筛检hucMSC-Ex中与血管形成相关的细胞因子

4．2．10 数据处理与统计

4．3 结果

4．3．1 hucMSC-Ex被EA．hy926细胞内化

4．3．2 hucMSC-Ex促进EA．hy926细胞的增殖

4．3．3 hucMSC-Ex促进EA．hy926细胞的迁移

4．3．4 hucMSC-Ex促进EA．hy926细胞的小管形成能力

4．3．5 hucMSC-Ex活化EA．hy926细胞中Wnt／β-catenin信号通路

4．3．6 hucMSC-Ex中含有血管形成促进因子

4．4 讨论

第五章 人脐带间质干细胞来源exosome的蛋白质组学分析

5．1 材料与仪器

5．1．1 主要材料

5．1．2 主要仪器

5．2 方法

5．2．1 样品前处理

5．2．2 SDS-PAGE和胶内酶解

5．2．3 LC-MS／MS质谱分析

5．2．4 蛋白质搜库

5．2．5 蛋白质注释和功能富集分析

5．3 结果

5．3．1 hucMSC-Ex中蛋白质的定性结果

5．3．2 hucMSC-Ex蛋白质组的功能富集分析

5．3．3 hucMSC-Ex蛋白质组的信号通路预测

5．4 讨论

第六章 结论与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文、参加的学术活动及获奖情况