苦柯胺B(Kukoamine B)对脓毒症小鼠小肠炎症反应的抑制作用及分子机制

摘要

目的：
　　Sepsis是由感染引起的全身炎症反应综合征，进一步发展将导致脓毒症性休克、多器官功能障碍，病死率居高不下，高达50％～60％，是当前临床上最具威胁性的并发症，是重症患者中、后期死亡的主要原因。研究显示，自20世纪60年代以来的近50年间，Sepsis的平均死亡率没有实质性改善，凸显了其巨大的治疗难度。
　　临床上，在未找到原发感染灶的死大亡脓毒症患者尸检中发现，大约33％的患者体内有明显的肠道细菌移位现象发生，诱发或/和促进休克、感染及创伤后“二次打击”的发生、发展，使机体免疫系统由预激活状态转化成爆发性激活，大量炎症介质释放、炎性细胞活化，造成生物体的严重损伤，甚至危及生命。脓毒症患者的胃肠问题统称为“胃肠功能障碍”，并将其作为MODS的一部分。近年来，胃肠功能障碍在脓毒症患者患者的治疗中的重要作用引起公众的关注，一方面，治疗中发现，胃肠道功能障碍在脓毒症患者中发生率很高，另一方面，胃肠功能障碍导致的肠源性感染能显著加重病情，造成细菌移位及营养不良的发生，在脓毒症的疾病的发生、发展过程中产生重要作用，严重影响疾病的预后。
　　许多文献报道，苦柯胺B(KukoamlneB，KB)以CpGDNA和脂多糖(LPS)为靶标，对重度、极重度脓毒症模型都具有明显的保护作用，但对脓毒症时小肠的炎症反应的作用机制并不明确。
　　方法：
　　研究分两个部分。
　　第一部分，建立脂多糖(LPS）诱导的小鼠脓毒症模型，通过观察全血中谷丙转氨酶（Alanine Aminotransferase， ALT）、谷草转氨酶(Aspartate Aminotransferase，AST)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen，BUN)及乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)含量，动态浊度法检测血浆LPS含量，ELISA法检测血浆中炎症因子(TNF-α和IL-1β)含量，空肠、回肠组织病理切片，对模型进行验证;通过检测苦柯胺B不同时间点进行干预对血浆LPS浓度的影响，确定苦柯胺B的干预时间。
　　第二部分，将24只ICR小鼠(Male)随机分成3组，分别是对照组、模型组、干预组，20 mg/kg LPS腹腔注射诱导小鼠脓毒症模型，对照组腹腔注射相同剂量20 mg/kg的生理盐水，模型制作结束后4小时，苦柯胺B20μ g/kg尾静脉注射进行干预。造模结束后8小时，观察小鼠活力及状态，取小鼠心脏血和空肠、回肠组织，光镜下观察空肠及回肠组织的病理改变，动态浊度法检测血浆LPS浓度水平，ELI SA法检测空肠、回肠组织匀浆中TNF-α和IL-1β含量，比色法检测空肠、回肠组织匀浆中髓过氧化物酶活性，比色法检测空肠和回肠组织脂质氧化产物丙二醛含量，(Griess Reagent法检测空肠和回肠组织中一氧化氮含量，WST-8法检测空肠和回肠组织总超氧化物歧化酶活性，FRAP法检测空肠和回肠组织总抗氧化能力，免疫组化法检测空肠、回肠组织中细胞间黏附分子-1表达;反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测空肠、回肠组织中诱导型一氧化氮合酶mRNA表达;蛋白质免疫印迹实验检测空肠、回肠组织中胞核蛋白核转录因子-κB p65表达水平。
　　结果：
　　1、苦柯胺B显著降低LPS诱导的脓毒症小鼠血浆中LPS浓度，降低空肠、回肠组织中炎症细胞因子TNF-α和IL-1β的表达，抑制小肠组织WPO活力，抑制小肠组织微血管通透性及间质水肿、白细胞浸润，显著改善小肠的病理损伤程度，提示KB能减轻脓毒症时炎症反应对机体的损害。
　　2、苦柯胺B显著提高LPS诱导的脓毒症小鼠空肠及回肠组织中总SOD水平、总抗氧化能力，明显降低脂质氧化产物MDA及NO水平，其机制可能与苦柯胺B明显提高脓毒症时机体的抗氧化能力，抑制机体的氧化应激反应，从而减轻炎症反应有关。
　　3、苦柯胺B显著减轻LPS诱导的脓毒症小鼠空肠及回肠组织中炎症反应程度，降低小肠组织ICAM-1、iNOS、NF-κ B表达水平，其机制可能与苦柯胺B能抑制NF-κB p65信号通路的活化，进而抑制其下游的炎症通路激活相关。
　　结论：
　　综上所述，本研究采用LPS诱导的脓毒症小鼠动物模型，对脓毒症时小肠炎症反应进行了系统的研究，并使用苦柯胺B进行干预，提示了苦柯胺B通过抑制NF-κB p65信号通路的活化来抑制机体的炎症反应，提高高脓毒症时小肠组织的抗氧化能力来降低机体的氧化应激反应，从而对脓毒症时小肠组织炎症反应起保护作用。

目录

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论文说明

摘要

英文缩写及符号索引一览表

前言

第一部分 小鼠脓毒症模型的建立与苦柯胺B药理特征、干预时间的确立

第一节 小鼠脓毒症模型的建立及验证

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二节 苦柯胺B药理特征及干预时间的确立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二部分 苦柯胺B对脓毒症小鼠小肠炎症反应的抑制作用及其机制

第一节 苦柯胺B对脓毒症小鼠小肠炎症反应的抑制作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二节 苦柯胺B对脓毒症小鼠小肠氧化应激反应的抑制作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第三节 苦柯胺B对脓毒症小鼠小肠炎症反应抑制作用的分子机制

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表文章