苦柯胺B对脓毒症时肝脏功能的保护作用及其机制

摘要

背景与目的:
　　脂多糖(LPS)是革兰阴性菌细胞壁的组成成分，作为外源性刺激因子可以触发细胞因子、NO等的合成、释放。严重的细菌感染可导致脓毒症的发生，并且脓毒症一旦触发可导致高死亡率，这与目前脓毒症的救治效果不佳密切相关。苦柯胺B(KB)是从中药地骨皮中提取出来的一种与LPS和CpG DNA具高亲和力的复合物。前期研究证实KB在LPS刺激的巨噬细胞及热灭活大肠杆菌诱导的脓毒症小鼠中均表现出很好的抗炎作用。而对LPS刺激的小鼠及中性粒细胞，KB的抗LPS作用尚无报道。本研究即采用LPS刺激的中性粒细胞体外模型及LPS腹腔注射诱导的脓毒症小鼠体内模型，系统研究了KB中和LPS的能力。
　　方法:
　　In vitro，运用LPS(1μg/mL)刺激的中性粒细胞为炎症模型，0.1-1μM KB进行干预，通过流式检测H2O2的水平，琼脂糖实验检测细胞迁移能力，western blot检测P-p38的表达水平，评价KB对LPS刺激的中性粒细胞功能的影响;in vivo，ICR小鼠腹腔注射LPS（20mg/kg）建立小鼠脓毒症模型，LPS注射4小时后尾静脉给予KB(20μg/kg)或是生理盐水。实验分为对照组，LPS组及LPS+KB组。各组均于LPS注射8小时后收集小鼠血液及肝脏组织。运用动态浊度法检测血浆中LPS的浓度，全自动生化仪检测血清中AST、ALT的水平，ELISA法检测血浆及肝脏组织中细胞因子（TNF-α、IL-1β）水平，分光光度计检测肝脏组织中MPO（髓过氧化物酶）的活性，免疫组化的方法检测肝组织中ICAM-1及VCAM-1的表达情况，评价KB对脓毒症时肝脏炎症反应的抑制作用;使用酶标仪对肝脏组织中的NO（一氧化氮）、MDA（丙二醛）及SOD（超氧化物歧化酶）进行检测，逆转录实时荧光定量PCR法检测iNOS mRNA的表达水平，评价KB对脓毒症时肝脏氧化应激损伤的保护作用;运用EMSA及Western blot方法对NF-κB的活化、表达进行检测，评价KB对脓毒症时NF-κB表达、活化的影响。
　　结果和结论:
　　1.KB可以下调LPS刺激的中性粒细胞p38的磷酸化水平，调控其ROS产生、趋化水平，初步证实了KB对LPS的体外中和作用。
　　2.KB能够显著降低LPS诱导的脓毒症小鼠血浆中LPS的含量，降低血清中AST、ALT的水平、减轻肝脏的病理改变，降低血浆及组织中细胞因子(TNF-α，IL-1β)的水平，抑制白细胞的浸润(MPO，ICAM-1，VCAM-1)，改善肝脏的功能，抑制肝脏炎症反应;
　　3.KB显著抑制LPS诱导的脓毒症小鼠氧化应激产物NO、MDA的产生，维护肝脏细胞膜的完整性，减轻氧化应激对炎症反应的促进作用，此外抗氧化酶(SOD)的增高，则可改善ROS（活性氧族）的过量产生，平衡ROS与抗氧化物间的不平衡。
　　4.KB可以显著减轻NF-κB p65的表达及NF-κB的活化，抑制因NF-κB活化、表达所导致的炎症反应、氧化应激产物增多。
　　综上所述，本实验采用LPS刺激的中性粒细胞为体外模型，LPS腹腔注射诱导的脓毒症小鼠为体内模型，对LPS激活的中性粒细胞的功能及脓毒症时肝脏的炎症反应、氧化应激、肝功能进行了评价，并使用KB进行干预，揭示了KB通过与LPS结合，中和了LPS的活性，致使LPS不能与相应受体结合，从而调控其后续的中性粒细胞ROS产生、趋化，抑制肝脏炎症反应、氧化应激，改善肝功能，保护肝脏。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩写及符号索引一览表

前言

第一部分 苦柯胺B对脂多糖刺激的中性粒细胞功能的影响：KB体外中和LPS的研究

第一节 分离和鉴定小鼠骨髓中性粒细胞

1 材料与方法

3 讨论

4 结论

第二节 中性粒细胞脂多糖刺激模型的建立与验证

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第三节 苦柯胺B对脂多糖刺激的中性粒细胞功能的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二部分 苦柯胺B对脂多糖诱导的脓毒症小鼠肝脏的保护作用及其机制：KB体内中和LPS的研究

第一节 建立与验证脓毒症小鼠模型

1 材料与方法

2．结果

3．讨论

4 结论

第二节 苦柯胺B的药理特性及苦柯胺B对脓毒症小鼠干预时间的确定

1 材料与方法

2．结果

3 讨论

4 结论

第三节 苦柯胺B对脂多糖诱导的脓毒症小鼠肝脏炎症反应的抑制作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第四节 苦柯胺B对脂多糖诱导的脓毒症小鼠氧化应激损伤的保护作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第五节 苦柯胺B对脂多糖诱导的脓毒症小鼠肝脏保护作用的分子机制

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

总结

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表文章