自噬参与表达狂犬病毒糖蛋白的重组新城疫病毒诱导的胃癌细胞的死亡

摘要

目的: 探讨自噬在新城疫病毒及表达狂犬病毒糖蛋白的重组新城疫病毒诱导的胃癌细胞死亡中作用，及其在自噬与凋亡、内质网应激及线粒体功能障碍之间相互关系。 方法: 1.病毒感染细胞的鉴定:对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901及AGS细胞24小时，分别加入新城疫病毒(NDV)及表达狂犬病毒糖蛋白的重组新城疫病毒(rl-RVG)感染，免疫荧光及免疫印迹测NDV狂犬病毒糖蛋白(RVG)的表达，PCR检测新城疫病毒HN基因及狂犬病毒糖蛋白基因的表达。 2.病毒的抗肿瘤活性:用处于对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901及AGS细胞为模型，分别以不同滴度的病毒感染肿瘤细胞24小时，MTT法测定细胞的生存率，评价病毒抗肿瘤活性。 3.细胞自噬的检测:处于对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901及AGS细胞分别感染新城疫及重组病毒后，免疫印迹方法检测自噬标签蛋白LC-3Ⅱ及Beclin-1，透射电镜检测自噬体的形成，评价病毒感染后细胞自噬水平的变化。 4.细胞凋亡的检测:以适当滴度的病毒分别感染对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901及AGS细胞24小时后，分别以TUNEL方法检测凋亡细胞及免疫印迹方法检测凋亡相关蛋白caspase3、8、9及bcl-2，bax的表达。 5.内质网应激的检测:以适当滴度的病毒分别感染对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901及AGS细胞24小时后，以免疫印迹的方法检测Grp-78，Hsp-90及细胞色素C的表达，评价细胞的内质网应激程度。 6.线粒体功能障碍的检测:以适当滴度的病毒分别感染对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901及AGS细胞24小时后，以JC-1染料检测胃癌细胞线粒体的跨膜电位的变化，评价胃癌细胞的线粒体功能。 7.自噬与凋亡的相互影响的检测:以自噬抑制剂3-MA及Beclin-1特异性的siRNA抑制自噬，用适当滴度的病毒分别感染人胃癌细胞SGC-7901及AGS细胞24小时，免疫印迹方法检测LC-3Ⅱ及Beclin-1蛋白确证自噬抑制后，用免疫印迹方法检测凋亡蛋白caspase系列，探讨自噬与凋亡的关系。 结果: 1.免疫荧光，蛋白印迹和PCR显示RVG蛋白或基因在rl-RVG转染的人胃癌SGC-7901及AGS细胞中表达阳性，NDV的HN蛋白或基因在rl-RVG或NDV转染的人胃癌SGC-7901及AGS细胞中表达阳性，对照组中RVG及HN蛋白均不表达。 2.rl-RVG和NDV转染的人胃癌细胞SGC-7901及AGS细胞中，MTT吸光度较对照组下降。 3.蛋白印迹显示rl-RVG和NDV转染的人胃癌SGC-7901及AGS细胞中自噬相关蛋白LC3及Beclin1的表达升高，且rl-RVG组升高更明显;透射电镜显示rl-RVG和NDV转染的起人胃癌SGC-7901及AGS细胞中较对照组细胞中大量自噬体形成，且rl-RVG自噬体多于NDV组。 4.蛋白印迹显示rl-RVG和NDV转染的人胃癌SGC-7901及AGS细胞中caspase3、8、9及bax/bcl-2的表达水平相对于对照组显著升高，且rl-RVG组升高更加明显。 5.蛋白印迹显示rl-RVG和NDV转染的人胃癌SGC-7901及AGS细胞中Grp78、HSP-90表达水平较对照组明显升高，cytochromec表达水平明显降低，透射电镜观察到rl-RVG和NDV转染的人胃癌SGC-7901及AGS细胞中内质网较对照组明显肿胀，且rl-RVG组内质网肿胀较NDV更为严重。 6.免疫荧光显微镜观察到JC-1染色后，rl-RVG和NDV转染人胃癌SGC-7901及AGS细胞中绿色荧光比率较对照组明显升高，且rl-RVG组较NDV组绿色更加明显。 7.抑制自噬后，蛋白印迹显示rl-RVG和NDV转染的人胃癌SGC-7901及AGS细胞中caspase3、8、9较自噬未抑制组表达下降。 结论: 1.rl-RVG和NDV均可转染人胃癌SGC-7901及AGS细胞，且rl-RVG感染效率更高。 2.rl-RVG和NDV可抑制人胃癌细胞SGC-7901及AGS的增殖，且rl-RVG抑制效率大于NDV。 3.rl-RVG和NDV均可引起人胃癌细胞SGC-7901及AGS的自噬，且rl-RVG感染的人胃癌细胞SGC-7901及AGS细胞中自噬更加的明显。 4.rl-RVG和NDV均可引起人胃癌细胞SGC-7901及AGS的凋亡，且rl-RVG凋亡诱导率高于NDV。 5.rl-RVG和NDV均可引起人胃癌细胞SGC-7901及AGS的内质网应激，rl-RVG感染的细胞中内质网应激较NDV组更加显著。 6.rl-RVG和NDV均可引起人胃癌细胞SGC-7901及AGS的线粒体功能障碍，且rl-RVG感染的细胞中线粒体功能障碍较NDV感染的细胞线粒体功能障碍更加明显。 7.抑制自噬后，rl-RVG和NDV感染的人胃癌细胞SGC-7901及AGS的凋亡率均较自噬未抑制组的感染相应的病毒的细胞的凋亡率下降。

目录

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摘要

缩写词表

引言

第一节 rl-RVG和NDV感染细胞的鉴定

第二节 rl-RVG和NDV的抗肿瘤活性

第三节 rl-RVG和NDV感染的细胞自噬水平的检测

第四节 rl-RVG和NDV感染的细胞凋亡水平的检测

第五节 rl-RVG和NDV感染的细胞内质网应激水平的检测

第六节 rl-RVG和NDV对胃癌细胞线粒体功能障碍的检测

第七节 rl-RVG和NDV诱导的胃癌细胞自噬与凋亡的联系

第八节 讨论

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文

综述 自噬和细胞凋亡的旁路联系

参考文献

致谢