超声辅助提取东北黑蜂蜂胶活性成分及其指纹图谱研究

摘要

蜂胶是蜜蜂从不同的植物收集的一种树脂蜂巢产品，其主要的活性成分有黄酮类、萜烯、酚酸及其衍生物类等，它具有抑菌、抗氧化、免疫调节和降血糖等生物活性。东北黑蜂具有很强的抗冻性，零下儿十度可以安全越冬，但是关于黑蜂蜂胶有效成分及其活性功能的研究工作较少。本文以抗氧化活性和抑菌活性为指标，进行了东北黑蜂蜂胶活性物质的极性筛选;研究了活性物质的超声辅助提取技术及其溶出动力学模型;采用扫描电镜、紫外、红外、GC-MS和LC-MS等分析方法对提取物进行了微观结构表征和指纹图谱分析。
　　主要研究工作及其结论如下:
　　(1)东北黑蜂蜂胶抗氧化和抑菌活性物质的极性筛选:采用甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯、苯和三氯甲烷等不同极性的溶剂萃取东北黑蜂蜂胶中的活性物质，研究了其活性成分存在的极性范围。研究结果表明，东北黑蜂蜂胶不同溶剂的萃取物均具有一定的抗氧化活性，其中甲醇提取物(ME)和乙醇提取物(EE)的抗氧化活性更最强;不同极性的提取物对除大肠杆菌以外的其它试验菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌）均具有抑制生长的作用，且甲醇和乙醇提取物的抑菌性最强。通过上述生物活性的测定，确定乙醇为东北黑蜂蜂胶活性成分提取的最佳溶剂。
　　(2)东北黑蜂蜂胶活性组分的单频逆流超声辅助提取:以黄酮和三萜总提取率为指标，研究了乙醇浓度、提取温度、超声时间、占空比和液料比对黄酮和三萜总提取率的影响。结果表明，液料比、提取温度、提取时间和占空比四个因素对目标提取物的提取效果影响较为显著。根据单因素试验方差分析结果，采用响应面实验设计与分析方法得到了东北黑蜂蜂胶主要活性成分最优提取条件为:乙醇浓度80％，液料比32∶1 mL/g、提取温度53℃、提取时间16 min、占空比10 s/5 s，在此条件下黄酮和三萜的提取率为61.11％，比不加超声的黄酮和三萜提取率提高了24％。
　　(3)东北黑蜂蜂胶活性组分在超声场下溶出动力学模型:对东北黑蜂蜂胶中黄酮和三萜的单频逆流脉冲超声辅助提取过程用二级动力学模型进行拟合发现，拟合度高，可以用于模拟、预测蜂胶中黄酮和三萜的逆流脉冲超声辅助同时提取过程与提取效果。
　　(4)东北黑蜂蜂胶醇提物指纹图谱的分析:通过对东北黑蜂蜂胶提取物进行电镜、红外和紫外光谱表征，确定了东北黑蜂蜂胶提取物的特征峰。东北黑峰蜂胶乙醇提取物在紫外区有2个吸收峰，在292 nm下有一个最强吸收峰，在356nm有一个很弱的吸收峰，推断可能是异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物。蜂胶提取物的红外光谱图上有15个特征峰，分别推断为烷烃类化合物、萜烯类化合物、黄酮类化合物、醇及酚。蜂胶醇提物的挥发性成分的主要活性物质是萜类化合物，分别为大根香叶烯、杜松烯、愈创木醇和芹子烯。通过蜂胶提取物的LC-MS的质谱图和标准品图推测出了7种可能的物质，分别为苯甲醛、咖啡酸、阿魏酸、香百酸、柯因、异鼠李素、山奈素，准确性还需要进一步通过核磁共振分析确认。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 问题的提出

1．2 东北黑蜂简介

1．3 蜂胶的研究现状

1．3．1 蜂胶活性成分研究进展

1．3．2 蜂胶的药理活性研究进展

1．3．3 蜂胶活性成分提取方法的研究进展

1．3．4 蜂胶质量控制的研究进展

1．4 本课题的研究目的和意义

1．5 本课题的研究内容

第二章 东北黑蜂蜂胶活性部位筛选

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 试验材料

2．2．2 试验仪器

2．3 试验方法

2．3．1 不同极性提取物的制备

2．3．2 蜂胶活性成分含量测定

2．3．3 抗氧化活性测定

2．3．4 抑菌活性测定

2．4 结果与分析

2．4．1 不同极性提取物的提取率及主要成分含量

2．4．2 DPPH自由基清除能力

2．4．3 羟自由基(·OH)清除率的测定

2．4．4 还原力测定

2．4．5 等价抗氧化能力大小

2．4．6 FRAP测定

2．4．7 抑菌活性测

2．5 本章小结

第三章 超声辅助提取东北黑蜂蜂胶黄酮和三萜技术研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料与试剂

3．2．2 仪器与设备

3．3 试验方法

3．3．1 蜂胶活性成分超声辅助提取的基本方法

3．3．2 黑蜂蜂胶黄酮和三萜提取参数的优化

3．3．3 总提取率及黄酮和三萜提取率的测定方法

3．4 结果与分析

3．4．1 黑蜂蜂胶活性成分超声波提取的单因素试验

3．4．2 回归方程的建立与分析

3．4．3 响应面交互作用分析

3．4．4 蜂胶黄酮和三萜提取工艺条件的优化

3．4．5 传统溶剂提取法试验结果与分析

3．5 本章小结

第四章 超声辅助提取东北黑蜂蜂胶黄酮和三萜的动力学研究

4．1 前言

4．2 试验材料试剂与仪器设备

4．2．1 试验材料及试剂

4．2．2 试验仪器与设备

4．3 试验方法

4．3．1 东北黑蜂蜂胶样品的准备

4．3．2 东北黑蜂蜂胶黄酮和三菇提取的试验设计

4．3．3 检测指标

4．3．4 东北黑蜂蜂胶黄酮和三萜提取动力学的建模

4．4 试验结果与分析

4．4．1 乙醇浓度对蜂胶黄酮和三萜提取效果的影响

4．4．2 温度对蜂胶黄酮和三萜提取效果的影响

4．4．3 液料比对蜂胶黄酮和三萜提取效果的影响

4．4．4 乙醇浓度对东北黑蜂蜂胶黄酮和三萜提取动力学的影响

4．4．5 温度对东北黑蜂蜂胶黄酮和三萜提取动力学的影响

4．4．6 液料比对东北黑蜂蜂胶黄酮和三萜提取动力学的影响

4．5 本章小结

第五章 东北黑蜂蜂胶指纹图谱分析

5．1 前言

5．2 试验材料与仪器

5．2．1 试验材料

5．2．2 试验仪器

5．3 试验方法

5．3．1 样品制备

5．3．2 电镜扫描

5．3．3 紫外谱图扫描

5．3．4 红外谱图扫描

5．3．5 GC-MS

5．3．6 LC-MS

5．4 试验结果分析

5．4．1 东北黑蜂蜂胶乙醇提取物的扫描电镜分析

5．4．2 东北黑蜂蜂胶乙醇提取物的紫外光谱分析

5．4．3 东北黑蜂蜂胶乙醇提取物的红外光谱分析

5．4．4 东北黑蜂蜂胶醇提取物的GC-MS图谱分析

5．4．5 东北黑蜂蜂胶超声处理的提取物的LC-MS图谱分析

5．5 本章小结

第六章 工作总结与展望

6．1 工作总结

6．2 工作展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间论文发表情况