IL-17通过抑制MDSCs凋亡影响小鼠抗瘤免疫应答的实验研究

摘要

目的：体外观察白细胞介素17（interleukin17，IL-17）对小鼠髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells）凋亡的影响，并探讨ERK1/2分子在其中的作用；于Lewis荷瘤小鼠体内研究IL-17是否通过调控MDSCs凋亡而影响肿瘤的生长。
　　方法：
　　（1）通过皮下注射Lewis细胞构建荷瘤小鼠模型，采用免疫磁珠分选技术（MACS）分离脾脏MDSCs细胞，常规培养。经IL-17处理后，使用AnnexinV/PI凋亡试剂盒检测MDSCs凋亡情况，通过Western-blot技术检测BCL-2的表达以及ERK1/2的磷酸化水平。
　　（2）在MDSCs培养体系中加入不同浓度ERK1/2分子磷酸化抑制剂（U0126）预处理，再经IL-17作用，运用AnnexinV/PI凋亡试剂盒检测MDSCs的凋亡情况并通过Western-blot技术检测BCL-2的表达水平。
　　（3）在荷瘤小鼠体内腹腔注射IL-17，2.5μg/只/次，共三次。观察肿瘤生长情况，测量肿瘤重量和大小；通过实时定量PCR（qRT-PCR）技术检测核蛋白（Ki67）mRNA、诱导性一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达情况。采用流式细胞术（FCM）检测树突状细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例，免疫荧光技术（IF）检测肿瘤组织中MDSCs的浸润情况。
　　（4）IL-17处理荷瘤小鼠后，通过MACS分选出MDSCs细胞。运用Western-blot技术检测细胞中ERK1/2磷酸化水平。常规培养后，使用AnnexinV/PI凋亡试剂盒检测MDSCs的凋亡情况，采用精氨酸酶（ARG-1）试剂盒检测ARG-1活性，运用Western-blot技术检测BCL-2表达水平。
　　(5) IL-17处理荷瘤小鼠后，使用吉西他滨清除荷瘤小鼠体内MDSCs，过继转移经U0126处理后的MDSCs（简称过继转移模型）。测量肿瘤体积、重量，采用qRT-PCR检测肿瘤组织中iNOS mRNA表达水平，通过MACS分选MDSCs，常规培养，使用AnnexinV/PI凋亡试剂盒检测MDSCs凋亡情况，使用ARG-1试剂盒检测ARG-1活性，运用Western-blot技术检测BCL-2表达水平。
　　结果：
　　(1) IL-17处理MDSCs细胞24h，对照组活细胞比例为（45.33±1.556）％，IL-17处理组为（59.55±2.831）%（ P<0.001），晚期凋亡细胞比例对照组为（22.87±1.349）%，IL-17处理组为（13.70±1.003）%（P<0.01）。Western-blot结果显示：IL-17处理组ERK1/2分子磷酸化水平（P<0.001）、BCL-2表达水平都明显上调（P<0.01）。
　　(2)在MDSCs培养体系中加入ERK1/2分子磷酸化抑制剂（U0126）预处
　　理，再加入IL-17处理。24h后，当U0126浓度为7.5μM时，空白对照组活细胞比例为（39.08±2.718）%，U0126处理组为（15.57±1.009）%（P<0.001），空白对照组晚期凋亡细胞比例为（8.007±1.777）%，U0126处理组为（26.95±1.179）%（P<0.01）。Western-blot检测发现，U0126处理组抗凋亡蛋白BCL-2表达明显减少。
　　(3)与PBS对照组相比， IL-17处理荷瘤小鼠后，肿瘤生长速度加快（ P<0.01），肿瘤体积增加[PBS组为2.753±0.7803cm3， IL-17处理组为6.000±0.8653cm3）（P<0.05）]，肿瘤重量增加[PBS组为1.886±0.2020g，IL-17处理组为3.480±0.4586g（P<0.05）]，核蛋白Ki67mRNA表达增加（P<0.05）。FCM结果显示：对照组脾脏中MDSCs数量为（2.187±0.2541）×107、比例为（13.40±0.3606）%， IL-17处理组数量为（3.967±0.1133）×107，比例为（24.43±1.1240）%（P<0.001）。IF结果显示肿瘤组织中MDSCs浸润数目增加， qRT-PCR检测发现肿瘤组织中iNOS mRNA表达增加（P<0.05）。
　　(4)与PBS对照组相比，Western-blot检测发现经IL-17处理后的荷瘤小鼠脾脏MDSCs中ERK1/2磷酸化水平、BCL-2表达水平明显上调（P<0.05）；ARG-1活性明显增强（P<0.05）。体外培养24h后， PBS对照组活细胞比例为（44.23±3.477）%，IL-17处理组为（59.33±2.718）%（P<0.05）；PBS对照组晚期凋亡细胞比例为（33.28±4.104）%，IL-17处理组为（19.26±2.494）%（P<0.05）。
　　(5)与对照组相比，过继转移经U0126处理的MDSCs后，脾脏和肿瘤组织中MDSCs分别减少了3.6%（P<0.05）、5.3%（P<0.01），肿瘤体积减小，肿瘤重量减轻（对照组为2.948±0.7537g，U0126处理组为0.7830±0.1597g）（P<0.05），肿瘤组织中Ki67mRNA（P<0.01）、iNOSmRNA的相对表达水平降低（P<0.05），脾脏分离出的MDSCs经培养后，凋亡水平明显增加，BCL-2表达量明显减少（P<0.001）。
　　结论：
　　（1） IL-17在体外能够通过增强ERK1/2分子的磷酸化抑制MDSCs的凋亡
　　（2） IL-17能通过抑制MDSCs的凋亡和增强其免疫抑制活性促进肿瘤的生长。IL-17在荷瘤小鼠体内可明显促进肿瘤生长，这种作用与IL-17抑制MDSCs的凋亡有关。