家蚕Hemolin蛋白与酚氧化酶在免疫过程中的相互关系

摘要

在昆虫体内发育和先天免疫是两个非常重要的过程，并且两者已经被证明使用很多相同或是相似的分子以及信号通路，家蚕 Hemolin 蛋白与酚氧化酶（phenoloxidase，PO）就属于这类在免疫和发育过程中发挥作用的双功能分子。两者各自已经有了许多的文献报道，但揭示两者关系的研究却极少。 两种蛋白都可由病原物刺激产生，由蜕皮激素所诱导，粘附于细胞表面而起作用，与脂质体颗粒密切相关。使用RNA干扰技术沉默hemolin基因后，酚氧化酶的活性降低，提示Hemolin可能在触发酚氧化酶原活化过程中起着重要作用。那Hemolin蛋白与酚氧化酶之间究竟是一种什么关系？ 我们首先制备了两种蛋白的抗体，制备的抗体用于研究其在病原物刺激家蚕后的组织定位和表达情况。然后根据两种基因的序列设计了荧光定量PCR的引物用来研究病原物刺激后的各基因的转录情况。另外我们还初步研究了酚氧化酶1（PO1）序列的多态性和Hemolin蛋白在不同情况下的蛋白修饰。 主要结果如下： 1. 利用克隆的po的两个亚型基因po1和po2构建了重组质粒，分别表达了这两种蛋白，并且以此免疫了新西兰大白兔制备了PO1和PO2蛋白的多克隆抗体。 2. 利用感染后家蚕中肠组织的石蜡切片以及血淋巴涂片通过双重免疫组化的方法研究了PO和Hemolin的定位关系：PO2分布于整个中肠组织中，而在血淋巴组织中Hemolin结合到血细胞上，PO1和PO2都有分布。 3.通过荧光定量PCR实验研究了三个基因在不同状况下的转录情况。研究结果发现家蚕无论是口添方式感染还是注射方式感染后，po1、po2以及hemolin的转录水平都会上升，但是上调程度和上调的时间段都有所不同，整体都呈现先上调后下降的趋势。 4. 通过Western blot分析研究了三种蛋白在不同状况下的蛋白表达，结果显示PO1主要在血淋巴组织中表达，中肠中几乎没有表达，脂肪体中有少量表达，血淋巴中表达主要在感染32-48h后开始上调，之后逐渐下调。PO2在中肠中有少量表达，脂肪体中有表达。Hemolin蛋白在三个组织中都有表达，注射组比口添组持续时间长。 5. 研究了po1基因在不同品系家蚕中的多样性，发现po1基因在不同品系家蚕中序列有一定的差异，保守性不如po2基因。我们还得到了不同状态下的Hemolin蛋白，以备研究它的糖基化和磷酸化修饰。 由以上研究我们得出结论：PO蛋白与Hemolin蛋白在免疫过程中共同作用用于抵抗病原物的感染，首先在细菌感染后PO1、PO2和Hemolin蛋白都定位在集聚的血细胞周围。其次病原刺激Hemolin高表达的时间上要早于PO的高表达，这些结论与我们提出的设想是一致的。

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