二穗短柄草(Brachypodium distachyon)Bra1基因的克隆、表达特征分析及其基因编辑体系的建立

摘要

植物细胞壁抗降解屏障是限制秸秆生物质资源化高效转化利用的关键因素，而木质纤维素的阿魏酸化是禾本科植物细胞壁抗降解屏障形成的重要分子基础。植物阿魏酰基转移酶（Feruloyl transferase）是负责将阿魏酸从阿魏酰CoA转移至阿拉伯木聚糖分子上的关键酶之一，在阿拉伯木聚糖与木质素的连接上起到关键作用，与植物细胞壁抗降解屏障的形成关系十分密切，因此对阿魏酰基转移酶基因开展研究将可以为禾本科能源植物开发利用以及农作物秸秆的再生利用提供新的思路。本文对禾本科模式植物二穗短柄草（Brachypodium distachyon）中的一个可能的阿魏酰基转移酶基因Bra1进行研究，其主要研究结果如下： 1. 以二穗短柄草成熟茎组织mRNA为材料，采用RT-PCR技术克隆得到了Bra1（5g14720）基因的全长 cDN A序列，其序列大小为1369 bp，生物信息学分析表明该基因的开放阅读框（ORF）编码443个氨基酸残基，其编码蛋白质的理论分子质量为48.45 kDa。进一步的基因原核表达以及蛋白质谱分析也表明该基因的开放阅读框能正确编码一个 B AH D酰基转移酶蛋白，其分子量大小与理论值基本一致。 2. Bra1 编码蛋白的氨基酸序列中包含有 BAHD 酰基转移酶家族特有的HXXXD功能区以及DFGWG保守结构域，说明Bra1基因是BAHD酰基转移酶基因家族的一个成员。对二穗短柄草基因组编码的89个BAHD酰基转移酶氨基酸序列的系统进化关系的分析发现，这些酰基转移酶大致划分为4个大的亚族，每个大亚族又包含几个小的亚族，Bra1蛋白（属于第I亚族）与前人研究过的与香豆酸（p-CA）代谢相关的酰基转移酶（属于第III亚族的第二个小亚族）不属于同一亚族，其蛋白功能可能存在差异。 3. 采用实时荧光定量PCR方法对BAHD酰基转移酶的编码基因中属于第III亚族的一个小亚族以及与第II I亚族亲缘关系较远的第I亚族中的10个基因的表达进行了分析，结果表明Bra1基因与其它9个基因相比较，其表达量高并且稳定，Bra1 基因在二穗短柄草成熟期的茎、叶和幼穗等组织器官中的表达量约为其幼苗期的2倍。将Bra1与绿色荧光蛋白GFP的融合基因在洋葱表皮细胞中瞬间表达进行Bra1重组蛋白的亚细胞定位分析，结果表明该Bra1蛋白主要定位于细胞质中表达。 4. 从Bra1基因外显子区筛选了2个基因编辑识别位点，构建了 Bra1基因的 CRISPR/Cas9 基因编辑植物表达载体，并通过根癌农杆菌介导转化二穗短柄草，获得了一批再生抗性植株，并初步利用PCR从中成功鉴定出3株基因编辑阳性植株。基因编辑位点的测序分析结果发现这3个植株Bra1基因序列中在第一个基因编辑位点出现单碱基缺失或插入突变，其中，有2棵植株同时检测到单碱基缺失或插入突变，另外1棵仅检测到单碱基缺失突变。而第二个基因编辑位点没有检测到突变。

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