纳米银对Escherichia coli细胞活性及可培养性的胁迫机制研究

摘要

纳米材料广泛应用的同时通过多种途径释放到环境中，由此引起的毒性效应成为关注的焦点。传统方法评估纳米材料毒性仅限于可培养细胞，并不适用于活的不可培养的（VBNC）细胞。作为一种典型的抗菌剂，纳米银（AgNPs）是否能诱导细胞进入VBNC状态尚未可知。另外，研究人员对 AgNPs 毒理机制至今尚未达成统一共识，大部分认为毒性主要归咎于Ag+释放，少部分认为与活性氧自由基（ROS）相关，机制研究有待进一步加深。因此，本课题以模式菌E. coli K12为研究对象，从生长评估、死活评估、细胞代谢评估三方面研究了AgNPs毒性效应；从AgNPs赋存状态转化、离子释放以及胞内ROS累积三方面探究AgNPs胁迫机制并通过外源添加四种解毒剂进一步深入解析。初步获得了以下几个主要结论： （1）光照和Cl?浓度影响AgNPs对微生物的毒性效应。在监测E. coli K12生长曲线的实验中发现，黑暗或者光照条件下，随着外源添加NaCl浓度升高AgNPs毒性呈先升高后降低的趋势；然而，平板计数结果与生长曲线结果有所差异，各处理组E. coli K12可培养的细胞数目远小于对照组，但光照和高浓度NaCl条件会提高可培养的细胞数目；另外，基于SYTO9/PI荧光染色法验证细胞死活，大部分细胞为活细胞并保持细胞膜完整性，说明E. coli K12进入VBNC状态；进一步检测ATP产量证实了细胞仍具代谢活性。因此，AgNPs诱导E. coli K12进入VBNC状态，且光照和高浓度NaCl条件介导了AgNPs对细胞VBNC状态的影响。 （2）AgNPs 赋存状态影响其抗菌毒性。NaCl 处理使AgNPs 接触角变小，易与亲水性细胞表面接触，导致更高毒性；AgNPs 稳定性和团聚程度影响其毒性，NaCl 浓度为50 mM时AgNPs的ζ电位绝对值最高，即在此条件下AgNPs有相对较好的稳定性和可溶性。另外，AgNPs倾向于发生团聚，且黑暗条件下AgNPs团聚程度相对较高；AgNPs氯化产物为AgClx1?x(aq)而非AgCl(s)，导致AgNPs较高毒性。 （3）AgNPs胁迫机制与离子释放和胞内ROS累积紧密相关。随着Cl?浓度升高， AgNPs溶解量逐渐增加，而且光照可轻微促进AgNPs氧化溶解；AgNPs处理使得E. coli K12胞内ROS水平显著提高，而外源添加Cl?可以减少胞内ROS产生。 （ 4 ） AgNPs 溶解导致的胞内 ROS 水平升高为其潜在的胁迫机制。Ag+络合剂（Na2S2O3和Na2S）和ROS清除剂（Vit C和rGSH）不仅可以去除AgNPs对E.coli K12的胁迫，而且可以降低胞内ROS产量至对照组水平。

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