人脐带间质干细胞来源外泌体在急性皮肤光损伤中的作用及机制

摘要

目的：随着臭氧层空洞日益加剧，人们接触紫外线( UV) 明显增多，长期接触过量UV易导致皮肤晒伤、光老化及肿瘤发生。据报道人脐带间质干细胞（human umbilical cord derived mesenchymal stem cells, hucMSC）条件培养基能保护UV损伤，延缓皮肤衰老。外泌体（exosome）是hucMSC旁分泌关键成分，大量存在其条件培养基中。然而，hucMSC-exosome（hucMSC-ex）对皮肤 UV 损伤作用未见报道，本文旨在探讨hucMSC-ex能否防治UV所致皮肤损伤及其作用机制。 方法：组织贴壁法分离 hucMSC ，成脂和成骨诱导实验鉴定hucMSC分化潜能；30%蔗糖密度梯度超滤离心法分离hucMSC-ex，蛋白质印迹分析其表面标记，透射电镜观察其形态和大小，Nanosight检测其粒径分布和浓度；hucMSC-ex预处理暴露皮肤，UVA和UVB辐照法制作 SD大鼠急性光损伤模型，大体观、HE和免疫组化等方法分析其防护效果；Western Blot检测组织蛋白PCNA、p-NF-κB和TNF-α表达，免疫组化和荧光检测组织 8-OHDG 和γH2AX 表达；共聚焦显微镜检测PKH-67标记hucMSC-ex被HaCaT细胞内化情况；UVB 和 H2O2 建立 HaCaT 氧化损伤细胞模型，免疫荧光分析hucMSC-ex 对活性氧自由基（ROS）表达影响；细胞免疫荧光检测PCNA和Caspase3表达量；Western Blot检测H2O2作用后HaCaT细胞增殖、凋亡、炎症情况，qRT-PCR分析HaCaT细胞SIRT1和TNF-α表达情况；Western Blot检测对照组和过表达14-3-3ζ组exosome 中14-3-3ζ和SIRT1表达情况；过表达14-3-3ζexosome（ad-14-3-3ζ-ex）与 H2O2 共处理 HaCaT 细胞，免疫荧光、Western Blot 和qRT-PCR 检测 SIRT1 表达情况；应用过表达 14-3-3ζ 腺病毒转染HaCaT细胞，免疫荧光和Western Blot检测细胞SIRT1表达变化。 结果：茜素油红O染色阳性；Exosome表达CD63和CD9，电镜下为“杯状”结构，Nanosight分析其直径在100nm左右；对照组皮肤光滑细腻、状态健康，而模型组皮肤明显红肿、脱屑、粗糙；HE显示对照组皮肤分层清晰，无病理变化，而模型组表皮细胞大片坏死，部分仍黏连，分层紊乱。真皮大量炎细胞浸润，网织纤维肿胀变性，而 hucMSC-ex 组表皮红肿、脱屑明显减轻，细胞坏死脱落明显减少，炎细胞浸润较少。DNA损伤产物显著减少，p-NF-κB水平显著下调， PCNA 明显上调；hucMSC-ex 在 HaCaT 胞质中富集， ROS和8-OHDG显著减少，Bax、p-NF-κB、TNF-α明显下调，PCNA、Bcl2显著上调；氧化应激条件下 HaCaT细胞SIRT1表达呈时间和剂量依赖性下调，而hucMSC-ex处理组SIRT1则显著高表达；过表达14-3-3ζexosome（ad-14-3-3ζ-ex）显著上调HaCaT细胞SIRT1水平，促进自噬活化，减少DNA损伤和细胞凋亡；过表达14-3-3ζ腺病毒转染HaCaT细胞显著促进SIRT1表达。 结论：HucMSC-ex携带14-3-3ζ促进HaCaT细胞SIRT1上调，减少ROS产生和DNA损伤，促进自噬活化发挥细胞保护作用，缓解UV和H2O2诱导的氧化损伤。

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