咪康唑与纤维蛋白协同促进神经干细胞分化及小鼠脊髓损伤修复

摘要

目的：探讨咪康唑和纤维蛋白能否协同促进神经球分化为成髓鞘样细胞，并构建神经干细胞-载咪康唑纤维蛋白胶的复合体移植入小鼠脊髓横断损伤模型，评价其修复脊髓损伤的能力。 方法： （1）培养并鉴定胎鼠神经球；以MTT法判定不同浓度的咪康唑对神经球存活的影响；选用适当的咪康唑浓度，将神经球按培养条件不同分为四组，对照组、咪康唑组（mico组）、纤维蛋白组（fibrin组）及纤维蛋白-咪康唑联用组（fibrin+mico组），培养两周后以免疫荧光染色比较髓磷脂碱性蛋白 （MBP）的表达；Western Blot法比较MBP、2′3′环核苷酸磷酸二酯酶（CNPase）、整合素、细胞外调节蛋白激酶及其磷酸化（ERK、p-ERK）的表达。 （2）将健康小鼠随机分为四组，每组20只，制作小鼠脊髓T10段横断模型：神经干细胞-载纤维蛋白支架组（N-FMS组）、载咪康唑的纤维蛋白支架组（fibrin-miconazole system FMS组）、纤维蛋白支架组（FG组）和单做脊髓横断手术组（SCI组）。术后2周开始对小鼠行双下肢功能活动（BBB）评分及改良Tarlov 评分，共评价至术后12周，而后获取脊髓组织标本，运用免疫组织化学染色观察脊髓断端的再生情况和Western blot技术检测脊髓横断部位标本的神经丝蛋白(NF200)，髓磷脂碱性蛋白（MBP),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达情况。 结果： （1）神经球阳性表达巢蛋白（nestin）和CD133。当咪康唑浓度低于或等于1.5μmol/L时，神经球存活在各组之间不存在统计学差异（P>0.05），但2.5μmol/L组显著低于2μmol/L组和1.5μmol/L 组（P<0.05）。免疫荧光结果表明：神经球分化所成的成髓鞘样细胞阳性表达MBP，呈多突起形态；fibrin组及mico组MBP相对荧光强度均高于对照组（P<0.05），fibrin+mico组神经球分化为网络状的成髓鞘样细胞团，其相对荧光强度高于其他组（P<0.05）。Western Blot结果表明：fibrin+mico组MBP及CNPase表达显著高于 mico 组和 fibrin 组（ P<0.05 ） ， fibrin+mico 组整合素表达及p-ERK/ERK显著高于mico组和fibrin组（P<0.05），同时咪康唑及纤维蛋白对MBP、CNPase、整合素的表达及p-ERK/ERK的效应具有交互作用（P<0.05）。 （2）BBB评分及改良Tarlov 评分显示，从术后2周至实验结束，每周N-FMS组的评分均高于其他三组（P<0.05）。与SCI组动物运动功能的毫无改善相比，FMS组及FG组动物运动功能有一定程度的恢复。 （3）Western blot技术检测动物脊髓标本：N-FMS组的NF200、MBP、相对表达量均高于FMS组、FG组和SCI组（P<0.05），GFAP则相反（P<0.05）。术后12周脊髓组织切片免疫组化显示，N-FMS组脊髓断端可见大量神经纤维相连，排列紧密规则，FMS组有少量纤维通过排布稀疏；FG组，有散在的神经纤维存在；SCI组神经元几乎全部凋亡，无阳性纤维通过。 结论： （1）咪康唑和纤维蛋白支架对神经球分化为成髓鞘样细胞具有良好的促进作用，其机制可能是通过两者协同促进ERK磷酸化发挥作用。 （2）构建神经干细胞-载咪康唑的纤维蛋白支架复合体移植是理想的修复脊髓损伤的方法。

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