地衣芽孢杆菌pelB，amyX，yvdF基因的功能鉴定与表达

摘要

地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中最具应用潜力的菌种之一，具有酶系丰富，产酶量高等诸多优良特性。地衣芽孢杆菌基因组序列已于2004年被公布，为利用基因工程手段开发其应用潜力提供了基础。本文从地衣芽孢杆菌基因组DNA中分别克隆了被标注为pelB、amyX和yvdF的基因，在大肠杆菌等不同宿主中表达出有活性的重组酶并对重组酶表达情况及酶学性质进行了分析。对地衣芽孢杆菌基因组序列分析后发现有两条基因可能编码果胶酶，分别被标注为pelA和pelB，其中对pelB基因的研究迄今未见报道。本文从地衣芽孢杆菌CICIM B1699染色体DNA中扩增出可能编码果胶裂解酶的基因pelB，插入启动子PQ下游，分别构建了重组质粒pLa-PQ-pelB和pHY-PQ-pelB。重组大肠杆菌JM109(pLa-PQ-pelB)表达出有活性的果胶裂解酶，酶活力为0.6 U/mL，上述实验证明了pelB基因编码的蛋白具有果胶裂解酶的功能。重组酶的酶学性质显示其最适反应温度为45℃，最适pH为10.5。金属离子Ca2+对重组酶具有激活作用，其中6 mmol/L Ca2+浓度激活作用最为明显，而Mg2+、Zn2+、Cu2+能强烈抑制酶活。利用HPLC-ESI-MS对重组酶酶解产物进行测定发现，酶解产物含有不饱和二聚半乳糖醛酸和不饱和三聚半乳糖醛酸。将重组质粒pHY-PQ-pelB导入地衣芽孢杆菌CICIM B1699，获得重组菌后进行发酵实验，发酵液中果胶裂解酶酶活达到4.2 U/mL，与原始菌株相比产酶水平提高了60%。
　　 本研究对地衣芽孢杆菌14580基因组序列分析显示，基因组中有两个基因amyX和yvdF，其编码的蛋白均具有典型的普鲁兰酶保守区，而有关其基因功能的研究均未见实验研究报道。以地衣芽孢杆菌CICIM B1699染色体DNA为模板通过PCR方法扩增获得amyX和yvdF编码区，分别构建了表达载体pHY-P43-amyX和pHY-P43-yvdF。含重组质粒pHY-P43-amyX的重组枯草芽孢杆菌1A717细胞内酶活有明显提高，但细胞外没有检测到明显酶活，该基因可能编码胞内普鲁兰酶。重组枯草芽孢杆菌1A717(pHY-P43-yvdF)表达出有活性的胞外普鲁兰酶，发酵液中酶活力达到4.6 U/mL，对其重组酶水解性质分析显示该酶可能为I型普鲁兰水解酶。重组酶酶学性质分析显示该两种重组酶的最适反应温度都为45℃，最适pH为6.5，其中重组酶AmyX在30-80℃热稳定性较好，而重组酶YvdF在55℃以上时迅速失活。重组酶反应不需要金属离子的参与，但是很多离子如Mg2+、Mn2+、Li+、Na+对酶活性有不同程度的促进作用；Zn2+、Cu2+、Co2+、EDTA、SDS对该酶有不同程度的抑制作用。将重组质粒pHY-P43-yvdF导入地衣芽孢杆菌CICIMB1699，测得重组菌的发酵上清液酶活力约为6.8 U/mL，较原始对照菌株B.licheniformisCICIM B1699酶活力水平高出2倍。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 地衣芽孢杆菌

1.2 果胶酶

1.2.1 果胶酶的分类

1.2.2 果胶酶的应用

1.2.3 果胶酶的研究进展

1.3 普鲁兰酶

1.3.1 普鲁兰酶的分类

1.3.2 普鲁兰酶的应用

1.3.3 普鲁兰酶的研究进展

1.4 本课题的立题意义及研究内容

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 工具酶和试剂

2.1.3 常用溶液及试剂的配制

2.1.4 培养基和培养条件

2.1.5 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 地衣芽孢杆菌B.licheniformis CICIM B1699染色体DNA提取

2.2.2 引物设计与PCR扩增

2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2.2.4 枯草芽孢杆菌感受态的制备及转化

2.2.5 地衣芽孢杆菌感受态的制备及转化

2.2.6 枯草芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌质粒DNA的提取

2.2.7 酶活力测定方法

2.2.8 重组酶酶活检测及酶学性质分析

2.2.9 重组质粒的稳定性分析

第三章 结果与讨论

3.1 地衣芽孢杆菌pelB基因的克隆与鉴定

3.1.1 地衣芽孢杆菌pelB基因的克隆

3.1.2 重组表达载体pLa-PQ-pelB及pHY-PQ-pelB的构建

3.1.3 重组菌E.coli JM109(pLa-PQ-pelB)酶活检测及重组酶酶学性质分析

3.1.4 重组菌.licheniformis CICIM B1699(pHY-PQ-pelB)的酶活力测定

3.1.5 重组质粒稳定性分析

3.2 地衣芽孢杆菌amyX基因的鉴定及其在枯草芽孢杆菌中的表达

3.2.1 地衣芽孢杆菌amyX基因的克隆

3.2.2 重组表达载体pHY-P43-amyX的构建

3.2.3 重组酶酶活力检测

3.2.4 重组酶AmyX的酶学性质分析

3.2.5 重组质粒pHY-P43-amyX稳定性分析

3.3 地衣芽孢杆菌普鲁兰酶基因yvdF在芽孢杆菌中的分泌表达

3.3.1 地衣芽孢杆菌的yvdF基因克隆

3.3.2 重组表达载体pHY-P43-yvdF的构建

3.3.3 表达产物的SDS-PAGE分析

3.3.4 重组酶YvdF酶学性质分析

3.3.5 产普鲁兰酶重组地衣芽孢杆菌的构建

3.3.6 重组质粒pHY-P43-yvdF稳定性分析

主要结论

致 谢

参考文献

作者在攻读硕士学位期间发表的论文