嗜热单孢菌角质酶的基因鉴定、高效表达及分子改造

摘要

角质酶是一种可以降解角质并产生大量脂肪酸单体的水解酶。角质酶是一种多功能酶，可水解可溶性酯、不溶性甘油三酯和各种聚酯，同时还能催化酸与醇的酯化、脂肪酸盐与醇的转酯化反应，因此在食品工业、化工工业等诸多领域都具有广泛的应用。近年来研究发现，角质酶可实现棉纤维的生物精练和合成纤维的生物改性，是推动纺织工业清洁生产的关键酶制剂。
　　 国外对真菌角质酶进行了深入的研究，但由于存在基因工程异源表达时表达量低和稳定性差等问题，至今没有实现工业化生产。与真菌角质酶相比，细菌角质酶具有催化效率高、基因工程异源表达技术成熟等方面的优势，但是国内外关于细菌角质酶的报道很少，迄今为止没有细菌角质酶基因鉴定的报道，因此细菌角质酶的研究受到限制。
　　 本论文完成了嗜热放线菌Thermobifida fusca角质酶的基因鉴定，实现了其在大肠杆菌中的高效表达及分子改造，主要结果如下：
　　 1.依次经过硫酸铵沉淀，Phenyl HP Sepharose FF疏水色谱，DEAE Sepharose FF阴离子交换色谱，从角质诱导的T.fusca发酵液中纯化得到电泳纯pNPB水解酶，比酶活由52.3 U/mg提高至398.6 U/mg，纯化倍数为7.6，回收率为9.3%。此外，通过硫酸铵沉淀，Phenyl HP Sepharose FF疏水色谱，CM Sepharose FF阳离子交换色谱，从重组Bacillussubtilis发酵液中纯化得到电泳纯Fusarium solani pisi角质酶。以F.solani pisi角质酶为对照品，苹果角质为底物，采用GC/MS分析，鉴定纯化得到的pNPB水解酶与F.solanipisi角质酶类似，能水解苹果角质并产生特征性产物，具有角质酶功能。
　　 2.纯化得到的T.fusca pNPB水解酶经肽指纹图谱鉴定，与数据库中Tfu_0882和Tfu_0883两个甘油三酯酶相符。通过N端测序得到纯化的蛋白N端前九个氨基酸为：ANPYERGPN。以T.fusca总DNA为模板，设计引物PCR得到编码Tfu0882和Tfu0883成熟蛋白的基因，并和具有PelB信号肽和6-His纯化标记的pET20b(+)质粒相连，使Tfu_0882和Tfu_0883在E.coli BL21(DE3)中过量表达。通过IPTG诱导，重组菌发酵上清液pNPB水解酶酶活Tfu0882为52.5 U/mL，Tfu0883为90.6 U/mL，分别是T.fusca诱导发酵液的4.37和7.56倍。采用Ni亲和柱对重组Tfu0882和Tfu0883进行分离纯化，纯化后重组蛋白达到电泳纯，重组Tfu0882和Tfu0883的pNPB水解酶比活力分别为223.1 U/mg、458.2 U/mg，并且两者均能水解角质并产生特异性产物，由此可确定，Tfu_0882和Tfu_0883是编码T.fusca角质酶基因。
　　 3.考察IPTG浓度和温度对重组大肠杆菌发酵生产Tfu0883的影响，发现不添加IPTG和25℃恒温培养效果较好，发酵80 h培养基中pNPB水解酶酶活达130.5 U/ml。在该条件下发酵生产Tfu_0883，周质空间有大量重组蛋白积累，跨外膜转运成为重组蛋白向培养基中分泌的限速步骤。通过添加膜透性增强剂和改变环境条件加速重组Tfu_0883从周质空间向培养基中分泌。研究表明，在对数生长中期，添加100 mM甘氨酸、1 mM表面活性剂TDOC均可将酶活最高点从80 h提前至54 h；采取重组大肠杆菌在25℃发酵至24 h时将培养温度提高至37℃的变温策略对重组蛋白的分泌有促进作用，酶活最高点出现于62 h，比不变温的对照提前了18 h。
　　 4.重组Tfu_0882、Tfu_0883和F.solani pisi角质酶在水溶液中均以单体形式存在。重组Tfu_0882、Tfu_0883的最适温度为60℃，并具有良好的热稳定性；重组F.solani pisi角质酶的最适温度为40℃，热稳定性较差。三种角质酶的最适pH均为8.0，pH稳定范围为6.0-9.0。三种角质酶均能够水解可溶性酯、不溶性甘油三酯和聚酯，并倾向于水解短链底物，没有位置特异性。F.solani pisi角质酶对pNPB底物的亲和力最大，催化效率最高；F.solani pisi角质酶水解PET能力最强，Tfu_0883次之，Tfu_0882对PET仅有微弱水解。三种角质酶都没有界面活化现象，不需要二价金属离子作为辅助因子，Mn2+对三者有激活作用，Cr2+和Hg2+对三种角质酶有强烈抑制作用。Triton X-100和Tween20抑制Tfu_0882和Tfu_0883的活性，对F.solani pisi角质酶无明显作用；SDS对三种角质酶均有竞争性抑制，Tfu0882抑制最弱；TDOC对F.solani pisi角质酶有明显激活作用。重组Tfu_0882和Tfu_0883在甲醇、乙醇等多种有机溶剂中具有良好的稳定性，F.solani pisi角质酶在有机溶剂中的稳定性较差。
　　 5.以Streptomyces exfoliates脂肪酶晶体结构为模板，通过SWISS-MODEL软件模拟得到Tfu_0883和Tfu_0882结构模型。模型显示，T.fusca角质酶具有典型的α/β水解酶结构，Tfu_0883的活性中心由S170-H248-D216催化三角组成，Tfu_0882的活性中心由S188-H266-D234催化三角组成。T.fusca角质酶活性中心上方没有盖子结构，活性中心暴露于溶剂中。角质酶基因Tfu_0882和Tfu_0883在基因组中处在相邻位置，并处于两个不同的操纵子中，受到不同的调控。Tfu_0882和Tfu_0883在水解角质过程中没有协同作用。在结构模拟的基础上进行理性分析，并成功构建了角质酶突变体Tfu_0883-1218A、Tfu_0883-W195A/F249A和Tfu_0883-Q132A/T101A，催化性质研究表明，突变体对小分子底物的催化没有明显影响；突变体Tfu_0883-1218A和Tfu_0883-Q132A/T101A水解角质能力明显提高；突变体Tfu_0883-Q132A/T101A水解PET聚酯的能力也得到明显提高。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 角质

1.1.1 角质的分布

1.1.2 角质的组成及结构

1.1.3 棉纤维中的角质

1.2 角质酶的性质及应用

1.2.1 角质酶的来源

1.2.2 角质酶的理化性质

1.2.3 角质酶的应用

1.3 角质酶的制备及分子改造

1.3.1 角质酶的基因及克隆表达

1.3.2 角质酶的分子改造

1.3.3 角质酶的生产

1.4 本论文的主要研究内容

1.4.1 立项依据及研究意义

1.4.2 本论文的主要研究内容

参考文献

第二章 T.fusca角质酶的分离纯化

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌株

2.2.2 试剂和仪器

2.2.3 培养基和培养条件

2.2.4 分析方法

2.2.5 T.fusca pNPB水解酶的纯化

2.2.6 F.solani pisi角质酶的纯化

2.2.7 角质的制备

2.3 结果与讨论

2.3.1 T.fusca角质酶的诱导制备

2.3.2 pNPB水解酶的分离纯化

2.3.3 pNPB水解酶角质水解能力研究

2.4 本章小结

参考文献

第三章 T.fusca角质酶基因的鉴定及克隆表达

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌株

3.2.2 试剂和仪器

3.2.3 培养基和培养条件

3.2.4 分析方法

3.2.5 肽指纹图谱测序

3.2.6 N-端测序

3.2.7 总DNA的提取

3.2.8 PCR扩增目的基因

3.2.9 PCR产物回收

3.2.10 载体连接

3.2.11 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

3.2.12 重组质粒的筛选与鉴定

3.2.13 定点突变方法

3.2.14 重组角质酶的纯化

3.3 结果与讨论

3.3.1 肽指纹图谱鉴定T.fusca角质酶基因

3.3.2 T.fusca角质酶的N-端测序

3.3.3 Tfu_0882和Tfu_0883基因的克隆

3.3.4 Tfu_0882和Tfu_0883基因在大肠杆菌中的表达

3.3.5 重组Tfu_0882和Tfu_0883的分离纯化

3.3.6 重组Tfu_0882和Tfu_0883角质水解能力研究

3.4 本章小结

参考文献

第四章 重组T.fusca角质酶的高效分泌

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌株

4.2.2 试剂和仪器

4.2.3 培养基和培养条件

4.2.4 分析方法

4.2.5 周质蛋白的释放

4.3 结果与讨论

4.3.1 重组Tfu_0883的发酵过程研究

4.3.2 IPTG诱导浓度对重组大肠杆菌发酵生产重组Tfu_0883的影响

4.3.3 温度对重组大肠杆菌发酵生产重组Tfu_0883的影响

4.3.4 甘氨酸对重组Tfu_0883分泌的影响

4.3.5 表面活性剂对重组Tfu_0883分泌的影响

4.3.6 两阶段温度控制对重组Tfu_0883分泌的影响

4.4 本章小结

参考文献

第五章 重组T.fusca角质酶酶学性质研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 角质酶

5.2.2 试剂与仪器

5.2.3 分析方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 角质酶分子量的测定

5.3.2 重组角质酶的最适温度及温度稳定性

5.3.3 重组角质酶的最适pH及pH稳定性

5.3.4 重组角质酶的底物特异性研究

5.3.5 重组角质酶的动力学分析

5.3.6 重组角质酶的油-水界面特性

5.3.7 金属离子对重组角质酶的影响

5.3.8 表面活性剂对重组角质酶的影响

5.3.9 重组角质酶在有机溶剂中的稳定性

5.4 本章小结

参考文献

第六章 T.fusca角质酶的催化机理初探及分子改造

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 菌株

6.2.2 试剂与仪器

6.2.3 培养基与培养条件

6.2.4 分析方法

6.2.5 定点突变方法

6.2.6 重组质粒的筛选与鉴定

6.2.7 转化大肠杆菌感受态细胞

6.2.8 抑制剂对角质酶的影响

6.2.9 角质酶的协同作用研究

6.3 结果与讨论

6.3.1 重组T.fusca角质酶的结构模拟

6.3.2 Tfu_0882和Tfu_0883催化角质水解机理初探

6.3.3 Tfu_0883的分子改造

6.4 本章小结

6.5 参考文献

结论

论文创新点

致谢

附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文