BL0033与BL0034在长双歧杆菌果糖ABC转运系统中功能的研究

摘要

双歧杆菌是人和动物肠道内栖居数量最多、功能最重要的生理性细菌,作为微生态学研究的核心,对宿主具有生物屏障、营养、免疫、控制内毒素血症、延缓衰老、抗肿瘤等生理作用,同时也是肿瘤基因治疗的一个十分理想的导向载体。目前,发酵活菌乳制品是双歧杆菌工业化生产的技术瓶颈,也是国际上发展双歧杆菌产业必须解决的关键问题。双歧杆菌在体内的营养主要来源于含果糖基的植物材料,因此探明双歧杆菌对果糖的转运及代谢机制,可以揭示其在肠道中的适应性,具有一定的理论意义和潜在的应用价值。
　　 本研究利用蛋白质组学和生物信息学确定了受果糖诱导调控的果糖转运相关蛋白,通过其基因克隆与表达,体外实验研究其与底物结合的特异性,采用GST沉降研究果糖转运系统蛋白质之间的相互作用。取得了以下主要结果:
　　 (1)采用pH4-7的IPG胶条对双歧杆菌的蛋白质样品进行双向电泳分析,明确其蛋白质在凝胶上的分布,结果表明在以果糖为碳源时其ABC转运系统中糖结合蛋白(BL0033)表达水平较高。
　　 (2)构建了bl0033基因表达载体pGEX-4T-1-bl0033,成功转化BL21并大量表达融合蛋白GST-BL0033;采用谷胱甘肽-Sepharose4B树脂珠粒对GST标签融合的蛋白进行了纯化,并发现BL0033能与果糖发生特异性结合。
　　 (3)构建了bl0034基因表达载体pGEX-4T-1-bl0034,成功转化BL21并大量表达融合蛋白GST-BL0034;采用谷胱甘肽-Sepharose4B树脂珠粒对该蛋白进行纯化,确定BL0034能结合ATP分子。
　　 (4)构建了bl0033、bl0034两基因表达载体pET32a-bl0033/bl0034,成功转化BL21并大量表达两蛋白;用镍柱对其进行纯化。采用GST沉降方法研究BL0033与BL0034之间的相互作用,发现BL0033和BL0034存在相互作用。
　　 表明双歧杆菌对果糖的吸收可能是通过BL0033和BL0034共同作用的一个特殊的转运系统来完成的。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略表

第一章 绪论

1.1 双歧杆菌的简介

1.1.1 双歧杆菌的生物特性

1.1.2 双歧杆菌的研究热点

1.2 长双歧杆菌NCC2705的研究进展

1.3 长双歧杆菌NCC2705果糖ABC转运系统

1.4 蛋白相互作用的研究方法

1.5 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要化学试剂与耗材

2.1.2 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 菌株、质粒和培养条件

2.2.2 培养基与常用溶液的配制

2.2.3 NCC2705全细胞蛋白的样品制备

2.2.4 双向电泳

2.2.5 半定量RT-PCR进行基因表达分析验证

2.2.6 BL0033、BL0034基因的克隆

2.2.7 重组表达质粒的构建

2.2.8 重组质粒在大肠杆菌中的表达

2.2.9 GST-BL0033、GST-BL0034融合蛋白的纯化

2.2.10 His-BL0033、His-BL0034融合蛋白的纯化

2.2.11 BL0033与果糖的结合

2.2.12 BL0034与ATP的结合

2.2.13 OST-pull down鉴定BL0033与BL0034之间的相互作用

2.2.14 GST-pull down结果的检测

第三章 结果与讨论

3.1 B.longum NCC2705 BL0033表达丰度的鉴定

3.2 BL0033、BL0034的体外功能验证

3.2.1 BL0034、BL0033基因的克隆、表达与鉴定

3.2.2 BL0033与BL0034体外功能验证

3.3 B.longum NCC2705 BL0033、BL0034相互作用的鉴定

3.3.1 BL0033与BL0034的GST-pull down

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

参考文献

附表

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