CTGF在人近端肾小管上皮细胞上皮—间充质转变中的作用研究

摘要

目的：肾间质纤维化是各种原因导致的终末期肾病的共同通路。最近研究表明肾小上皮细胞间充质转变(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)是肾间质纤维化中的核心事件。结缔组织生长因子(ConnectiveTissueGrowthFactor,CTGF)是新近发现的一个重要的致纤维化因子。从蛋白结构看CTGF由4个不同的模块组成，CTGF在体内以包含不同模块的全长及不同长度的片段形式存在。人们发现CTGF具有许多复杂甚或相互矛盾的作用，联系到其多模块的结构特点，有作者开始从结构-功能学角度来探讨CTGF的作用基础。在这些先锋性的实验中提示模块4可能具有较为突出的作用。CTGF在多种慢性肾脏病中表达增高，提示CTGF与慢性肾脏病进展相关，进一步的工作发现CTGF能参与肾脏细胞的增殖、EMT及增加肾间质纤维物质堆积等多种肾脏纤维化的事件。有关CTGF在肾脏纤维化中的结构学基础如何?是否其致纤维化效应由模块4介导?目前尚未见报道。本研究采用重组的不同片段的CTGF来直接研究CTGF在EMT中的作用及其结构基础。 方法：人近端肾小管上皮细胞株(humanproximaltubularcellline，HPTCL)HK-2用含10％胎牛血清(fetalcalfserum，FCS)的低糖型Dulbeccos'sModifiedEagle'sMedium(DMEM)培养液培养。无血清培养24小时后，用重组CTGF(C)(只包含模块4)干预细胞，通过MTT法监测细胞增殖指数，摸索出最适浓度-时间点，用流式细胞分析技术检测其对细胞周期的作用及抗CTGF抗体对这一作用的影响。选取50ng/mlrhCTGF(C)干预细胞0-48h，通过免疫细胞化学、Real-TimePCR观察其对角蛋白、波形蛋白表达的影响，同时通过倒置相差显微镜观察细胞形态改变，采用共聚焦显微镜技术观察其对纤维连接蛋白表达的影响。在此基础上我们还采用免疫细胞化学、Real-TimePCR技术观察0-72hILK(integrin-linkedkinase)mRNA和蛋白质表达时间效应关系；观察不同浓度rhCTGF(C)(0-50ng/ml)作用细胞48h后，HK-2细胞ILKmRNA和蛋白质表达的浓度效应关系。同时我们还观察了抗CTGF抗体对rhCTGF(C)的这些作用的影响以及比较了rhCTGF(N)(包含模块1，2，3不包括模块4)对这些指标的作用。 结果：结果显示在50ng/ml范围内rhCTGF(C)能促进HK-2细胞增殖，呈浓度依赖性增强(P＜0.05)。在100ng/ml-lug/ml浓度范围内rhCTGF(C)呈浓度依赖性抑制HK-2细胞生长(P＜0.05)。50ng/mlrhCTGF(C)作用HK-2细胞12h后即可显著性诱使HK-2细胞增殖(P＜0.05)，此作用呈时间依赖性增强。rhCTGF(C)作用48h后，G0-G1期细胞减少(p＜0.05)，S期细胞增多(p＜0.01)，anti-CTGFantibody干预后能明显减轻这一现象(P＜0.05)。rhCTGF(C)可以呈时间依赖性下调CK(cytokeratin)mRNA和蛋白质表达及上调VIM(vimentin)mRNA和蛋白质表达(P分别＜0.05vscontrol)。RhCTGF(C)可以明显使HK-2细胞伸长为长梭形。rhCTGF(C)可以增加FN(fibronectin)的合成，呈时间依赖性(P＜0.05)。RhCTGF(C)在5ng/ml时就可以增加ILKmRNA和蛋白质表达，呈浓度依赖性(P＜0.05)。RhCTGF(C)作用24h起即可上调ILKmRNA和蛋白质表达(P＜0.05)，并呈时间依赖性。抗CTGF抗体可以阻断这些作用(P＜0.05)，而rhCTGF(N)与正常对照组相比无明显改变。 结论： 1.在一定的浓度范围内，重组的CTGF模块4蛋白可以促进肾小管上皮细胞的增殖，呈浓度和时间依赖性；加速肾小管上皮细胞从G1期向S期的转变。 2.重组的CTGF模块4蛋白可以诱导肾小管上皮细胞发生EMT，而rhCTGF(N)未能诱导肾小管上皮细胞发生EMT。 3.重组的CTGF模块4蛋白可以促进肾小管上皮细胞细胞外基质的合成，而rhCTGF(N)未能促进细胞外基质的合成。 4.在一定的浓度范围内，重组的CTGF模块4蛋白可以直接促进ILKmRNA和蛋白的表达，呈浓度和时间依赖性；rhCTGF(N)未能促进ILK的表达。

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文摘

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前言

文献综述上皮间充质转变及其在肾间质纤维化中的作用

材料与方法

研究内容

研究结果

讨论

结论

致谢

参考文献

作者简介

附录 几种CTGF蛋白模式图：