新分离致病螺原体单克隆抗体的制备及初步应用

摘要

2002年王文等首次在水生动物体内发现致病螺原体，并根据“科霍氏法则”确定其为中华绒螯蟹(crab)颤抖病的病原体[1,2]。随后相继在发病克氏原螯虾(crayfish)和南美白对虾(prawn)体内分离培养出致病螺原体[28]。虾蟹颤抖病是近年来水产养殖上的一大瘟疫。2006年，我国养殖的水产甲壳类动物因病害造成的直接经济损失为49.5亿元，其中对虾类损失28.43亿元，蟹类损失19.83亿元，严重制约着水产养殖业的发展。目前，国际上对虾蟹螺原体的分类鉴定还有待完善，虾蟹颤抖病病原体是新发现的致病微生物，鉴定需经过分离培养，宿主来源、血清学以及分子生物学的分析，根据国际系统细菌学委员会(ICSB)制定的标准来鉴定和分类，其中一个重要的金标准是模式株的血清学鉴定[40]。此外，对其免疫学特性的研究，如中和抗原表位及特性，抗体对其生长抑制情况，抗原性差异与分子特性等，仍是空白。水产养殖业快速检测病原体的手段有限，都是迫切需要解决的问题。因此，本研究制备了抗虾蟹螺原体的单克隆和多克隆抗体，并初步探讨其应用价值。 本研究用分离纯培养的中华蟹螺原体(S.crab)、南美白对虾螺原体(S.prawn)、克氏原螯虾螺原体(Scrayfish)混合物免疫Balb/c小鼠，按常规方法融合，得到2株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为6H7和7C8。再分别用中华绒螯蟹螺原体(Scrab)和南美白对虾螺原体(S.prawn)免疫家兔，按常规方法制备了抗S.crab抗血清和抗S.prawn抗血清。 免疫印迹试验显示：6H7和7C8单抗均能与中华蟹螺原体(Scrab)、南美白对虾螺原体(Sprawn)和克氏原螯虾螺原体(S.crayfish)反应，而不与S.mirum、蜜蜂螺原体(Ssp.CH-1)、油菜花螺原体(S.sp.CR-1)以及螺原体培养基等反应。间接ELISA试验显示：两株单抗与Smirum，Ssp. CH-1，Ssp. CR-1以及支原体呈阴性反应，说明两株单抗均为针对虾蟹螺原体的特异性抗体。也从免疫学角度证明S.crab，S.prawn和S.crayfish与以往人们熟知的支原体、蜜蜂和油菜花螺原体有不同的抗原表位和免疫学特性。抗Scrab和抗S.prawn多克隆抗体Western blot和ELISA结果显示：两种多抗均与S.mirum有交叉反应，从血清学角度提示虾蟹致病螺原体与S.mirum的亲缘关系接近。此前王文也报道，Scrab和S.mirum的16S rRNA基因有98％以上的同源性[2]。 同时，为了进一步考查该致病螺原体是否会感染哺乳动物，本研究以单克隆抗体为工具，应用Western blot的方法检测接种虾蟹致病螺原体半年以上的小鼠脑、脊髓、脾脏、肌肉等组织，未发现螺原体的存在，提示暂无证据表明新型虾蟹致病螺原体可以感染哺乳动物。 综上所述，本实验制备了抗虾蟹致病螺原体的特异性单克隆抗体和多克隆抗体。四种抗体的制备和初步分析结果在血清学上为虾蟹致病螺原体的分类鉴定，确定种属间关系提供了新的依据，为其免疫学特性及致病性的深入探讨提供了可靠的工具，同时为建立可靠的快速检测虾蟹致病螺原体奠定了良好的实验基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩写词

声明

绪言

文献综述：螺原体的研究进展

第一章新分离螺原体单克隆抗体的制备及初步应用

前言

材料和方法

结果

讨论

第二章抗新分离螺原体多克隆抗体的制备、鉴定

前言

1.材料

2.主要实验方法、原理及步骤

结果

讨论

小结和展望

参考文献

作者简介及研究生学习期间发表文章和成果

致谢