结缔组织生长因子单克隆抗体超微超顺磁氧化铁纳米粒子的制备及生物活性研究

摘要

研究目的：通过分子探针成像显示标记的靶目标，是目前分子成像的主要机制，而制备特异靶向性的分子探针是活体分子成像的关键因素。超顺磁性氧化铁(superparmagneticiron oxide，SPIO)纳米分子探针因其良好的生物相容性及磁共振(MRI)信号敏感性而成为研究热点。本研究通过化学修饰合成方法制备结缔组织生长因子(connective tissuegrowth factor,CTGF)单克隆抗体超微超顺磁氧化铁(ultrasmall superparamagnetic ironoxide，USPIO)粒子分子探针，检测其免疫活性、稳定性及细胞毒性，同时进行体外细胞水平特异靶向性试验，为该分子探针在体成像打下基础，进而为动态研究纤维化相关病理过程和心血管疾病发生机制提供新方法。
　　 研究方法：1.采用二巯基丁二酸(meso-2,3-dimercaptosuccinic acid，DMSA)修饰的化学共沉淀法制备DMSA包被γ-三氧化二铁纳米粒子(γ-Fe2O3)，并通过乙基二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride，EDC)化学连接剂，将抗CTGF单克隆抗体与DMSA包被的超顺磁氧化铁纳米颗粒以生成化学共价键的形式相结合，形成具有免疫活性的分子探针，通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及Western blotting方法检测其免疫活性及生物稳定性。2.采用体外人脐静脉内皮细胞株的培养方法，运用MTT法及台盼蓝活细胞计数法检测该分子探针的细胞毒性；用含30mmol/L葡萄糖的1640培养液干预2天后，将合成的分子探针与干预细胞共孵育后通过铁染色、磁共振成像及透射电镜等方法进行体外水平细胞特异靶向性检测。
　　 结果：1.应用EDC法制备成CTGF单克隆抗体超微超顺磁氧化铁粒子，ELISA方法所得的吸光度值(OD)有随加入抗体含量增多而增高的趋势，与未结合抗体的USPIO组相比较差异显著(P＜0.05)，在间隔30d和60d后再次测量，只有200μg单抗组OD值有所下降，特别是0d与30d相比差异显著(P＜0.05)，其余组未见明显变化。Westernblotting试验中，结合单抗的USPIO及单纯单抗均显示出条带，而BSA-USPIO对照组则未显示条带。2.通过台盼蓝染色活细胞计数，MTT法测得吸光度(OD)值并进行毒性评级。结果显示，各不同浓度的标记单抗USPIO组与阳性对照组(聚丙烯酰胺单体)比较均有显著差异(P＜0.05)，而与阴性对照组(1640培养液)比较均无显著差异(P＞0.05)，同时该合成材料毒性评级为0-1级，属于无细胞毒性范畴。普鲁士蓝染色可见，只含血清1640培养液的单纯细胞组，基本无蓝色铁颗粒出现。标记有CTGF单抗铁粒子组与BSA-USPIO组及标记非特异性单抗铁粒子组相比，于细胞内外明显可见大量的蓝染铁颗粒。通过7.0T微型磁共振扫描仪扫描结果示，标记CTGF单抗铁粒子组、BSA-USPIO组、标记非特异性单抗铁粒子组与单纯细胞组的T2弛豫时间比较呈不同程度降低(P＜0.05)，同时，标记CTGF单抗铁粒子组与BSA-USPIO组、标记非特异性单抗铁粒子组的T2弛豫时间相比明显减少，(P＜0.05)，且T2加权图像的信号强度也显著降低。通过透射电镜技术(TEM)观察CTGF单抗氧化铁纳米粒子及BSA-USPIO与细胞共孵育后，前者在细胞内及表面均可见到电子致密物沉积，后者在细胞溶酶体内未见或见到少量电子致密物沉积，其胞内分布明显少于前者。
　　 结论：1.EDC化学合成方法可制备出CTGF单克隆抗体超微超顺磁氧化铁粒子，同时其仍具有抗体的免疫活性及生物稳定性。2.本实验制备的CTGF单克隆抗体超微超顺磁氧化铁纳米粒子对细胞无毒性，且在细胞水平上对人脐静脉内皮细胞具有较好的特异靶向性，可进一步进行体内水平的研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要缩略词表(中英对照)

声明

前言

文献综述分子影像学研究进展

第一部分 结缔组织生长因子单克隆抗体超微超顺磁氧化铁纳米粒子的制备及免疫活性研究

材料和方法

1材料

2方法

3结果

4讨论

5结论

第二部分 结缔组织生长因子单克隆抗体超微超顺磁氧化铁纳米粒子的细胞毒性及体外特异靶向性研究

材料和方法

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

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