I通道辅助亚基KCNE1C-末端缺失突变体的功能分析

摘要

KCNE1，为电压依赖性钾离子通道KCNE1/KCNQ1(亦称IKs通道)的调节亚基，该通道介导心肌细胞动作电位中的复极化IKs电流。而KCNE1对于该通道独特的慢激活特征的维持是不可替代的。据文献报道KCNE1的胞内片段(C-端)在调控IKs通道动力学特征上起主要作用，但具体的部位并不十分清楚。另据文献报道kcnel基因的突变可致临床上具有很高致死率的心率不齐疾病心脏长QT综合征的五型(LQT5)。
　　 近年来有研究发现多态性位点(single nucleotide polymorphism，SNP)也具有潜在的致病性，但与LQTS的关系尚不十分明确。基因库的资料表明，人源kcnel存在一个SNP位点318C/A(氨基酸：106C/Ter)，318A造成终止密码子提前出现，导致KCNE1胞内C-末端24个氨基酸的缺失(末端缺失片段称C24，末端缺失C24的突变体称KCNE1-△24)。通过基因同源性比对进一步发现，C24在不同种系的KCNE1间有很高的同源性，但在不同种系KCNE家族成员(KCNE1-5)间的同源性却很低，提示C24片段与KCNE1的独特功能有关。因此，本文拟通过建立突变体KCNE1-△24，研究该突变体与KCNQ1之间的相互作用，分析该突变体的功能。
　　 利用分子克隆和点突变技术构建了野生型的KCNE1和突变体KCNE1-△24，并在HEK293及CHO细胞系中进行瞬时表达。蛋白免疫印迹、细胞免疫染色和免疫共沉淀的结果表明，该突变体在细胞系中的表达、亚细胞定位与野生型KCNE1无明显差异，说明C24片段缺失不影响其表达、亚细胞定位及与KCNQ1的装配。全细胞膜片钳记录数据表明，该突变体与野生型KCNQ1所形成的通道呈现电压依赖性曲线右移及通道激活速率变慢，而通道的电流密度无显著性变化。
　　 本文的数据提示，末端缺失C24片段的突变体KCNE1-△24可与野生型KCNQ1形成功能性通道；该突变通道在生物物理学特征上明显不同于野生型的通道，表现为通道的开放时程变慢及开放所需的激活电压变正。由此我们推测，SNP位点318C/A导致的C24片段缺失的KCNE1突变体可能会因延长心肌细胞复极化过程而致Q-T间期延长。目前尚未见该突变体所致KCNE1/KCNQ1通道功能异常及临床上相关LQT5病例的报道。我们将在原代培养的心肌细胞中，对该突变体的潜在致病性作进一步的研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪 言

第1章文献综述 Iks通道辅助亚基KCNE1的研究进展

1.1长QT综合症

1.1.1 LQTS致病原因

1.1.2遗传性LQTS分型

1.2 KCNE1

1.2.1 KCNE1简介

1.2.2 KCNE1发现

1.2.3 KCNE1的功能

1.2.4 KCNE家族

1.3 KCNE1与LQTS

1.3.1 KCNE1突变与LQTS的研究

1.3.2 KCNE1的SNP位点与疾病

1.3.3 KCNE1突变导致LQTS的原因分析

1.3.4基因突变的筛查方法

1.4.1 KCNE1突变体与功能的关系的研究

1.4.2 KCNE1对KCNQ1的调控作用机制

1.4.3 KCNE1功能域的研究

1.5研究KCNE1的意义与展望

第2章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验用细胞系

2.1.2实验用宿主菌及质粒载体

2.1.3主要试剂及试剂盒

2.1.4论文中使用的溶液及缓冲液

2.1.5细胞及细菌培养基等

2.1.6主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1 常规分子克隆方法

2.2.2点突变

2.2.3细胞培养

2.2.4质粒转染及全细胞蛋白提取

2.2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白印迹

2.2.6免疫共沉淀

2.2.7细胞免疫荧光染色

2.2.8全细胞膜片钳记录

第3章实验结果与讨论

3.1 引言

3.2 C24缺失突变体KCNE1-△24的构建及体外表达分析

3.2.1 前言

3.2.2野生型KCNE1表达载体的构建

3.2.3点突变构建C24缺失突变体KCNE1-△24

3.2.4突变体KCNE1-△24的表达分析

3.2.5 KCNE1-△24细胞内定位分析

3.2.6 KCNQ1表达检测

3.2.7讨论

3.3 KCNE1-△24与KCNQ1相互作用分析

3.3.1 前言

3.3.2 KCNE1-△24免疫染色实验

3.3.3 KCNE1-△24与KCNQ1体外免疫共沉淀实验

3.3.4讨论

3.4 KCNE1-△24对KCNQ1的调控作用分析

3.4.1 前言

3.4.3 KCNE1-△24/KCNQ1通道电压依赖性分析

3.4.4 KCNE1-△24/KCNQ1通道在60mV电压下开放速率分析

3.4.5 KCNE1-△24/KCNQ1通道电流密度分析

3.4.6讨论

工作总结与展望

致 谢

参考文献

作者简介