内皮祖细胞移植对睾丸扭转复位后生精功能的影响及机制

摘要

目的:建立一种高效、稳定的获取大鼠骨髓源性内皮祖细胞(endothelial progenitorcells,EPCs)的方法,探讨EPCs的归巢特征以及。EPCs移植对睾丸扭转复位后生精功能的影响及其可能机制。
　　 方法:(1)采用密度梯度离心法获取大鼠骨髓源性单个核细胞,置于EGM-2MV中进行培养、扩增,利用免疫细胞化学染色鉴定EPCs表面标志CD31、CD34、Ⅷ因子,双荧光染色观察EPCs内吞Dil-acLDL及结合FITC-UEA-1的能力。(2)EPCs培养7d时,采用携带增强型绿色荧光蛋白的重组腺病毒(Ad-eGFP),按重复感染倍数(multiplication of infection,MOI)=50时转染EPCs,72h后在荧光显微镜下观察eGFP在EPCs中的表达并计算转染效率。(3)建立睾丸扭转复位模型,并将动物分为三组,每组6只,假手术组:左侧睾丸未扭转；缺血再灌注损伤组(IRI组):睾丸扭转复位后经大鼠股静脉注射1ml生理盐水；内皮祖细胞(EPCs组):睾丸扭转复位后经大鼠股静脉注射1ml细胞悬液(EPCs数为1.0×106个)。另外对3只睾丸扭转复位后大鼠进行Ad-eGFP转染后的EPCs移植。术后5d,采用活体荧光成像系统及组织冰冻切片技术,观察移植EPCs的归巢特征,检测各组睾丸组织病理变化、凋亡细胞／生精小管情况以及睾丸组织VEGF mRNA和蛋白表达水平。
　　 结果:(1)成功获取大鼠骨髓源性EPCs。培养10d时,EPCs表面标志CD31、CD34、Ⅷ因子阳性率均超过80％,EPCs可内吞Dil-acLDL、表面可附着FITC-UEA-1。(2)转染72h后,Ad-eGFP对EPCs的转染效率大于73.7％,在荧光显微镜下可见绿色荧光阳性的细胞。(3)术后5d,活体荧光成像系统显示左侧阴囊区域有较强的荧光信号,其他区域则未见荧光信号。通过荧光显微镜,可见左侧睾丸组织中有分布不均的绿色荧光细胞,而在脾脏、肝脏、肾脏组织中则未发现。假手术组生精小管结构及细胞正常,凋亡细胞／生精小管为0.09±0.02。IRI组生精细胞稀少,凋亡细胞／生精小管为2.82±0.81。EPCs组生精上皮较IRI组显著增厚,生精细胞增多,EPCs组凋亡细胞／生精小管为0.32±0.09,显著低于IRI组,差异有统计学意义(P<0.05)。假手术组与EPCs组比较,凋亡细胞／生精小管无明显变化(P=0.42)。与假手术组比较,IRI组、EPCs组VEGFmRNA及蛋白表达均显著升高(P<0.05)；与IRI组比较,EPCs组VEGFmRNA及蛋白表达显著升高(P<0.05)。
　　 结论:成功获取大量骨髓源性EPCs,携带增强型绿色荧光蛋白的重组腺病毒可高效转染EPCs,可作为一种高效标记EPCs的方法。EPCs移植后可定向归巢于患侧睾丸,改善睾丸扭转复位导致的生精功能障碍,产生保护作用,其机制可能与EPCs增殖分化为血管内皮以及释放VEGF有关。