吡格列酮对自发性高血压大鼠心肌纤维化的作用及对心肌间质胶原代谢的调控机制

摘要

研究背景:左室肥厚是高血压病常见的靶器官损害，其病理学基础是心肌细胞肥大、心脏成纤维细胞(cardic fibroblasts，CFs)的过度增殖和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积即心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)。心肌纤维化与心室僵硬度增加，心脏舒张收缩功能减退，心肌缺血和心源性猝死密切相关。因此，如何预防和逆转高血压心肌纤维化是目前治疗高血压的重要目的之一。心肌纤维化是高血压左室重构的主要表现之一，主要原因是心肌间质胶原合成与降解代谢之间失衡，以及各型胶原比例（主要是Ⅰ/Ⅲ比例）发生改变。CFs是心肌组织中含量最多的细胞，占心肌细胞总数的2/3，是心肌胶原合成最主要的细胞。胶原的降解主要由基质金属蛋白酶(metalloproteases，MMPs)调节，而MMPs降解胶原的活性受内源性金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)的影响，MMPs/TIMPs的平衡对维持胶原的正常代谢有重要作用。因此，抑制CFs的增殖及胶原的合成并促进其降解是预防与逆转心肌纤维化，改善心功能的关键环节。过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(peroxisome prolifterator-activated receptor gamma，PPARγ)是一类配体依赖的核转录因子，可通过与靶基因的反应元件结合直接控制多种基因，参与调节糖、脂质代谢、炎症、细胞凋亡、细胞迁移增殖与动脉粥样硬化等病理过程。据报道活化的PPARγ可抑制血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)与缺氧刺激所致CFs胶原的合成，并减少激活物蛋白1(activator protein-1，AP-1)与细胞核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)与靶基因的结合活性。但是它对压力负荷大鼠心肌间质胶原代谢尤其对MMPs/TIMPs平衡是如何调控的以及机制目前不十分清楚。对这些问题进行深入研究，不仅有助于阐明心肌纤维化的细胞和分子机制，而且可为PPARγ激动剂扩大应用领域，为其应用于预防和逆转心肌纤维化提供理论基础。
　　 第一章吡格列酮对大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原代谢的影响及机制探讨
　　 目的:
　　 探讨吡格列酮在AnglⅠ诱导CFs增殖、胶原代谢中的影响，尤其对MMPs/TIMPs的作用。明确PPARγ和ROS/ERK1/2信号转导通路在AnglⅠ诱导CFs增殖、胶原代谢中的作用。
　　 方法:
　　 1、采用改良的四氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法测定细胞增殖;流式细胞仪(flow cytometry，FCM)分析技术检测细胞周期。
　　 2、分光光度法测定CFs羟脯氨酸含量。
　　 3、实时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)测定MMP-1、MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA表达量。
　　 4、酶谱分析法(Zymography)测定明胶酶活性。
　　 5、蛋白免疫印迹(Westem blot，WB)技术测定CFs MMP-1、TIMP-1和PPARγ蛋白水平。
　　 6、荧光显微镜技术和FCM测定CFs的活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平。
　　 7、免疫细胞化学以及WB测定细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)磷酸化水平。
　　 结果:
　　 1、CFs增殖和细胞周期的检测:MTT检测结果显示:AngⅡ干预组OD值明显高于对照组(P＜0.05)，并在一定时间内呈时间依赖性;吡格列酮+AngⅡ组OD值明显下降(P＜0.05); PPARγ拮抗剂GW9662组能拮抗吡格列酮的作用(P＜0.05);NAC+AngⅡ组和U0126+AngⅡ组OD值明显低于AngⅡ组(P＜0.05）。流式细胞仪检测示AngⅡ刺激后处在G0-G1期细胞百分比较正常对照组明显减低（P＜0.05），处在S期细胞百分比较正常对照组明显升高(P＜0.05）;吡格列酮预处理后，G0/G1期细胞增加，S期细胞减少，与AngⅡ组的差异有显著性(P＜0.05)，对G2/M期细胞无明显影响;GW9662组能逆转吡格列酮对细胞周期的作用，差异有统计学意义(P＜0.05); NAC和U0126治疗后G0-G1期细胞百分比明显升高，S期百分比相对于AngⅡ组明显下降（P＜0.05）。
　　 2、各组羟脯氨酸含量结果:AngⅡ刺激CFs24小时后，羟脯氨酸含量较正常对照组明显升高(P＜0.05);加入吡格列酮干预后，羟脯氨酸含量均较AngⅡ刺激组明显下降(P＜0.05），GW9662不能逆转此作用，且联合使用能进一步降低心肌胶原含量，显示吡格列酮并不是完全通过PPARγ途径来干预胶原代谢;NAC和U0126可明显抑制AngⅡ刺激的羟脯氨酸的生成(P＜0.05）。
　　 3、MMP-1、MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达的结果:实时荧光定量PCR显示:AngⅡ作用CFs24 h后，降低MMP-1 mRNA水平为62％(P＜0.05)，上调MMP-2和TIMP-1基因的表达2.67±0.39和5.32±0.92倍（P＜0.05），对MMP-9无影响;WB显示:与CON组比较，AngⅡ作用CFs24 h后MMP-1蛋白表达减少(P＜0.05)，TIMP-1蛋白表达增加(P＜0.05); AngⅡ使MMP-2和MMP-9活性增高(P＜0.05）。吡格列酮治疗后，MMP-1 mRNA水平增高并能降低MMP-2和TIMP-1 mRNA的表达;能逆转AngⅡ作用的MMP-1和TIMP-1蛋白的表达（P＜0.05），并且降低MMP-2和MMP-9活性(P＜0.05)。GW9662治疗组并不能逆转吡格列酮的作用。NAC+AngⅡ组治疗后MMP-1 mRNA和蛋白表达分别为0.90±0.13和0.68±0.13，MMP-2和TIMP-1 mRNA表达分别为1.53±0.21和4.07±0.41，均较AngⅡ组显著性降低(P＜0.05);并能抑制AngⅡ诱导的MMP-2和MMP-9的活性。U0126+AngⅡ组治疗后不能改变MMP-1和TIMP-1 mRNA和蛋白表达(P＞0.05);MMP-2和MMP-9 mRNA表达分别为1.67±0.22和1.30±0.19，MMP-2 mRNA表达较AngⅡ组显著性降低(P＜0.05)，对MMP-9 mRNA表达无显著差异(P＞0.05); U0126治疗后能抑制AngⅡ诱导的MMP-2和MMP-9活性增高（P＜0.05）。
　　 4、PPARγ蛋白表达:AngⅡ组PPARγ的蛋白表达光密度值明显低于对照组（P＜0.05），吡格列酮治疗组PPARγ表达明显高于AngⅡ组(P＜0.05），GW9662组PPARγ比值明显下降P＜0.05）。
　　 5、ROS表达以及ERK1/2磷酸化与核转移:流式细胞仪检测和荧光显微镜结果显示:AngⅡ作用CFs不同时间，ROS水平均显著高于对照组（P＜0.05）;吡格列酮和抗氧化剂NAC能抑制AngⅡ诱导的CFs中ROS升高，与AngⅡ组相比，差异具有显著性（P＜0.05）;GW9662不能逆转吡格列酮对ROS的作用，表明PPARγ不直接参与此过程。WB测定显示，AngⅡ作用15min后心肌成纤维细胞ERK1/2磷酸化显著升高（0.88±0.10），30 minERK1/2磷酸化达到最大(1.12±0.16)，与对照组（0.20±0.03）比较，有显著性差异(P＜0.05)。免疫细胞化学染色显示:AngⅡ促进磷酸化ERK1/2核转移，AngⅡ作用30 min后，磷酸化的ERK1/2大量出现在细胞核内，细胞核出现强染色，与对照组相比，AngⅡ引起了磷酸化ERK1/2的核转移(P＜0.05);NAC+AngⅡ组显著减少AngⅡ诱导的CFs ERK1/2磷酸化;吡格列酮+AngⅡ组CFsERK1/2磷酸化降低，与AngⅡ组比较有显著性差异(P＜0.05);这种作用不能由GW9662抑制。
　　 第二章吡格列酮对自发性高血压大鼠心肌纤维化及胶原代谢的调控
　　 目的:在自发性高血压大鼠动物模型中，评价吡格列酮对心肌纤维化及胶原代谢的调控作用，尤其是对MMPs/TIMPs的平衡的影响。然后通过对PPARγ通路、活性氧水平的检测，进一步探讨吡格列酮调控心肌纤维化的机制。
　　 方法:16只12月龄雄性SHR大鼠随机分为吡格列酮组(n=8)和SHR对照组即SHR组(n=8)，8只同龄的雄性WKY大鼠做正常对照。吡格列酮组给予10mg/kg/d灌胃给药8周，SHR组及WKY组给予等量生理盐水灌胃8周。实验过程中，进行以下检测:
　　 1、分别于实验开始前、实验末测量各组大鼠体重及尾动脉血压。
　　 2、实验末测定血糖、血肌酐、血尿素氮、血胆固醇、血甘油三脂和胰岛素水平。
　　 3、常规超声心动图检查大鼠心脏结构和功能。
　　 4、测定各组大鼠左室重量指数(left ventricular mass index，LVMI)。
　　 5、病理学检查进行心肌胶原定性分析。
　　 6、生化法检测心肌羟脯氨酸含量以确定心肌胶原蛋白含量。
　　 7、实时定量RT-PCR方法检测各组大鼠心肌MMP-1、MMP-2、MMP-9及其TIMP-1 mRNA表达情况。
　　 8、Westen blot法检测各组大鼠心肌MMP-1和TIMP-1蛋白表达。
　　 9、明胶酶法检测MMP-2和MMP-9活性。
　　 10、分光光度计测定各组大鼠心肌ROS和超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase，SOD)水平。
　　 11、三组大鼠心肌PPARγ mRNA表达和组织定位。
　　 结果:
　　 1、与同月龄WKY组相比，12月龄SHR组血压明显升高(P＜0.05);与SHR组相比，8周吡格列酮治疗组血压明显下降(P＜0.05)，仍高于WKY组(P＜0.05）。
　　 2、各组血糖、血脂和肾功能相比，均无统计学意义(P＞0.05);吡格列酮组血胰岛素水平有降低趋势，但无统计学意义(P＞0.05）。
　　 3、超声心动图检测显示:与WKY组相比，SHR组室间隔厚度(interventricular septal thickness，IVSd)和左室后壁厚度(left ventricle posterior wall thickness，LVPWd)均明显增加(P＜0.05），E/A比值明显减小(P＜0.05);与SHR组相比，吡格列酮组IVSd、LVPWd均明显降低(P均＜0.05），E/A比值明显增大(P＜0.05）;左室射血分数(ejection fraction， EF)和左室短轴缩短率(fractional shortening，FS)在各组没有显著性差异(P＞0.05）。
　　 4、SHR组大鼠LVMI（3.06±0.23 mg/g）明显较WKY组（2.11±0.15 mg/g）增高(P＜0.05)，吡格列酮组(2.27±0.20 mg/g)较SHR组显著降低(P＜0.05）。
　　 5、HE染色显示:正常WKY大鼠组心肌纤维排列整齐;SHR组心肌细胞肥大、心肌纤维排列疏松紊乱，甚至断裂;吡格列酮组心肌细胞肥大改善、心肌细胞排列较为整齐，胞内心肌纤维断裂情况明显好转。Masson染色可见:WKY组胶原组织分布稀疏，相邻细胞的胶原纤维网完好;SHR组血管周围及心肌间质胶原显著增多;吡格列酮组胶原纤维较SHR组心肌间质胶原纤维明显减少，排列较规整。SHR组大鼠心肌胶原容积分数和心肌血管周围胶原面积分别8.78±0.50％，2.46±0.12％，与WKY组（3.47±0.57％、0.92±0.10％）比较，均有显著性差异(P＜0.05）;吡格列酮组（4.25±0.52％、1.28±0.12％）与SHR组比较，也有显著性差异（P＜0.05）。
　　 6、与WKY组相比，SHR组心肌羟脯氨酸含量（733.21±89.10μg/g）显著增加(P＜0.05);吡格列酮组心肌羟脯氨酸含量(641.86±48.16μg/g)较SHR组明显减少（P＜0.05），但仍高于WKY组(488.85±51.01μg/g，P＜0.05)。
　　 7、与WKY组相比，SHR组MMP-1、MMP-2和TIMP-1 rnRNA表达明显增加(P＜0.05);吡格列酮治疗后MMP-1mRNA表达进一步增加(P＜0.05），MMP-2和TIMP-1 mRNA表达明显减少(P＜0.05），三组大鼠MMP-9 mRNA相比没有统计学意义(P＞0.05)。与WKY组相比，SHR组MMP-1/TIMP-1和MMP-2/TIMP-1均降低（P＜0.05）;与SHR组相比，吡格列酮组MMP-1/TIMP-1和MMP-2/TIMP-1升高(P＜0.05)。
　　 8、与WKY组比较，SHR组左室心肌组织MMP-1和TIMP-1蛋白表达增加(P＜0.05）;吡格列酮组能降低TIMP-1蛋白表达(P＜0.05），进一步增加MMP-1蛋白表达(P＜0.05);与WKY组比较，SHR组MMP-1/TIMP-1无显著差异(P＞0.05)，吡格列酮组能增加此比值（P＜0.05）。
　　 9、与WKY组比较，SHR组左室心肌组织MMP-2和MMP-9活性增加(P＜0.05);吡格列酮治疗后大鼠MMP-2和MMP-9活性降低(P＜0.05）。
　　 10、SHR组心肌组织ROS和SOD水平分别为33.42±1.73 U/mg prot、116.8±12.9 U/mg prot，与正常WKY组大鼠（12.45±1.38 U/mg prot、163.5±15.6 U/mg prot）相比，均存在显著差异(P＜0.05）;吡格列酮组治疗8周后与SHR组相比，ROS浓度（22.7±1.53 U/mg prot）显著下降(P＜0.05)，心肌SOD（126.2±8.3 U/mg prot）浓度升高，但没有统计意义(P＞0.05)。
　　 11、与WKY组相比，SHR组PPARγ mRNA表达明显减少(P＜0.05）;与SHR组相比，吡格列酮组PPARγ mRNA表达明显增多(P＜0.05）。免疫组化显示PPARγ主要定位于细胞浆，在各组心肌组织中表达无差异(P＞0.05），SHR组微血管平滑肌细胞层PPARγ表达明显减少(P＜0.05)，吡格列酮组PPARγ表达增多（P＜0.05）。
　　 结论:
　　 1、吡格列酮可显著抑制CFs细胞增殖和调节心肌胶原代谢，这种有益的作用可能通过PPARγ和ROS-ERK1/2信号通路实现。
　　 2、14月龄SHR已出现明显的心肌纤维化。
　　 3、吡格列酮通过下调SHR大鼠左室心肌MMP-2和TIMP-1表达水平和活性，上调MMP-1的表达来调节MMPs/TIMPs平衡促进胶原降解，从而抑胶原的沉积，抑制心肌纤维化。
　　 4、PPARγ激动剂吡格列酮改善心肌纤维化的机制可能是通过激活PPARγ和抑制ROS的形成。

目录

声明

摘要

主要缩略词表

前言

综述

第一章 吡格列酮对大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原代谢的影响及机制探讨

实验一 吡格列酮对大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原代谢的影响

前言

材料与方法

结果

实验二 PPARγ和ROS／ERK1／2途径在吡格列酮对大鼠心脏成纤维细胞增殖及胶原代谢中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

第二章 吡格列酮对自发性高血压大鼠心肌纤维化及胶原代谢的实验研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介