IL11R介导放射性多肽分子探针对前列腺癌骨转移瘤受体显像与放射靶向治疗

摘要

前列腺癌是发病率最高的非上皮恶性肿瘤，其骨转移发生率亦高。前列腺癌骨转移的早期特异诊断与靶向治疗一直是临床工作难点，目前相关的特异性检测手段和治疗药物尚不令人满意，这主要与缺乏肿瘤特异性靶向分子及相关技术手段的不足有关，其关键问题在于寻找合适的载体和肿瘤细胞作用的靶点。近年迅速发展的分子成像技术有望实现恶性肿瘤骨转移的动态实时追踪及可视化定量检测，可能成为解决这一问题的突破口。受体靶向性核素内放射治疗与肿瘤血管抑制治疗相结合的肿瘤放射受体治疗，是目前研究最活跃的前沿领域之一。受体与其配体的结合具有特异性、选择性、饱和性、亲合力强和生物效应明显等特点，利用配体作为放射性核素的载体，通过受体介导作用，增加药物在病灶局部的浓度、提高药效，降低毒副作用，达到靶向诊治目的，有望解决单纯肿瘤血管抑制治疗中的一些问题。分子成像技术及放射受体治疗均有赖于高亲和力的特异性靶向分子。白细胞介素11类似物环九肽c(CGRRAGGSC)是一种通过噬菌体随机肽库筛选获得的前列腺癌细胞特异性结合肽，具有优良的小分子多肽的靶向特性。本研究拟采用环九肽作为前列腺癌骨转移瘤特异显像的靶向载体，构建放射性小分子探针，探讨其体内外结合特性与作用机制，为包括前列腺癌在内的恶性肿瘤骨转移特异分子靶向诊疗技术提供科学依据。
　　研究目的：成功构建放射性核素标记白细胞介素11类似物环九肽c(CGRRAGGSC)介导的放射性小分子探针方法，获得稳定性好，标记率高，生物活性不改变的标记产品；通过对IL11受体(IL11R)高表达的肿瘤细胞及实体瘤的体内外靶向性结合实验、SPECT动态γ显像及药理学研究，探讨放射性小分子探针特异诊断IL11R表达阳性肿瘤及骨转移灶的靶向示踪机理，研究荷人前列腺癌细胞受体放射治疗量效关系，并初步探讨其作用机制。
　　研究内容：1.间接细胞免疫荧光染色和免疫印迹蛋白分析观测雄激素依赖型前列腺癌细胞株LNcap与雄激素非依赖型前列腺癌细胞株PC-3、Du-145细胞膜IL11R表达情况，以正常前列腺上皮细胞RWPE-1作对照；用近红外染料LSS670复染，细胞化学荧光检测c(CGRRAGGSC)在前列腺癌PC-3细胞中的定位及内化作用。加入不同浓度c(CGRRAGGSC)干预各组细胞，计算存活细胞率和72h半数抑制率(IC50)，观察c(CGRRAGGSC)对不同前列腺癌细胞株的作用。
　　2.制备99Tcm/153Sm-DTPA-c(CGRRAGGSC)小分子探针，纸层析法和高效液相色谱测定标记率、放射化学纯度等。观察两种放射性小分子探针体外稳定性和生物活性，受体放射配基结合分析实验鉴定受体亲和力及受体细胞密度。
　　3.体外抑制实验：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同药物对照组100μl PBS(A)组，c(CGRRAGGSC)100μl/1.5mg/L(B)组、153SmCl3370kBq/100μl(C)组和153Sm-DTPA-c(CGRRAGGSC)370kBq/100μl(D)组对人前列腺癌PC-3细胞24、48、72h的生长抑制作用；流式细胞术分析48h细胞凋亡及细胞周期变化；免疫印迹蛋白检测药物处理前和处理后48h PC-3细胞中IL11及IL11R表达变化。
　　4.体内分布实验：观察99Tcm-DTPA-c(CGRRAGGSC)在正常ICR小鼠和荷前列腺癌骨转移瘤模型裸鼠体内生物学分布，计算各组织器官每克组织百分注射剂量率(％ID/g)。
　　5.体内γ显像实验：动态观察(5只模型鼠)自尾静脉注射99Tcm-DTPA-c(CGRRAGGSC)7.4 MBq(0.2 ml)在荷人PC-3前列腺癌骨转移瘤BALB/c裸鼠模型体内0.5，1，2，4，6，8和24 h表现；与99Tcm-亚甲基二膦酸盐(MDP)骨显像比较，采用感兴趣区(ROI)法计算99Tcm-DTPA-c(CGRRAGGSC)显像肿瘤/对侧正常骨骼放射性(T/NT)比值，并用此2种显像剂进行裸鼠骨折模型显像比较：进行体内竞争抑制显像(3只荷瘤裸鼠)观察标记物生物学活性。
　　6.体外治疗实验：PC-3细胞随机分为4组，注入A组PBS100μl，B组1.5mg/Lc(CGRRAGGSC)100μl，C组153SmCl3370kBq/100μl，D组153Sm-DTPA-c(CGRRAGGSC)370kBq/100μl，照射2h后换液。计算细胞抑制率，流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡和坏死率，观测免疫组化检测；Western blot检测治疗后IL11R表达的改变。
　　结果：1.免疫荧光染色和免疫印迹蛋白结果显示三种前列腺癌细胞均存在IL11R阳性高表达，正常前列腺上皮细胞RWPE-1亦存在少量表达，PC-3细胞IL-11R表达量是正常前列腺细胞的21.2倍。荧光示踪下复染分子探针结合在PC-3细胞膜及胞浆。c(CGRRAGGSC)作用72h后对各前列腺癌细胞半数抑制浓度分别为：LNcap=23.14nM、PC-3=38.01nM、Du-145=28.51nM，均区别于RWPE-1=769.8nM(P<0.05)。
　　2.99Tcm-DTPA-c(CGRRAGGSC)标记率90.7％，HPLC即时测放射化学纯度为(99.57±0.09)％，室温放置1、2、3、4、6、8和24h，放射化学纯度依序为(99.29±0.18)％、(98.95±0.78)％、(98.67±0.11)％、(96.53±0.91)％、(95.2±0.7)％(88.38±0.22)％和(36.17±1.29)％。153Sm-DTPA-c(CGRRAGGSC)标记率>85％，放化纯>95.8％，比活度为1.32×105MBq/μmol。在4℃生理盐水中可以保持32h稳定。分子探针与IL-11R结合具有饱和性和可逆性，Kd值为3.2±0.02nmol/L，Bmax为754±34fmol/mg pro。
　　3.体内分布实验：①经正常ICR小鼠尾静脉注射99mTc-DTPA-c(CGRRAGGSC)后主要经肾排泄，体内放射性清除迅速。各时相重要组织脏器普遍摄取较低，肌肉和脑最低，4h骨骼、肝摄取达峰值，分别为(1.410±0.109)和(0.366±0.030)％ID/g。各器官差异均有统计学意义(P<0.05)。②荷瘤裸鼠尾静脉注射99mTc-DTPA-c(CGRRAGGSC)，标记物主要经肾脏排泄，各时相重要组织脏器普遍摄取较低，4h瘤体、骨骼、肝脏的％ID/g达峰值，分别为1.512±0.119、0.703±0.183和0.246±0.091，各器官均有差异(P<0.05)。注射后24h体内放射性消失。
　　4.体内显像：正常裸鼠注射99Tcm-DTPA-c(CGRRAGGSC)后0.5h全身软组织略显影，双肾膀胱显影明显；1h后脊柱骨髓、四肢关节髓腔轻度放射性显影，双肾放射性显影明显；4h较为清晰，6h后影渐淡，近本底水平，膀胱间或显影；各时相体内其他重要组织脏器仅见本底影。荷瘤鼠99Tcm-DTPA-IL11RRγ动态各时相显像类似正常裸鼠；唯移植瘤开始即显影，1h瘤体放射性明显摄取，46 h最明显，边界清晰，瘤体放射性异常摄取程度近似充盈的膀胱；脊柱骨髓、四肢关节髓腔和和双肾4h时影像较为清晰，6h放射性迅速减少；24h可见瘤体和膀胱淡影。感兴趣区(ROI)测量0.5～8h左股骨移植瘤/对侧正常骨骼放射性比值(T/NT)依序为1.17±0.17、2.20±0.29、3.20±0.15、3.67±0.23、13.61±0.85、9.45±0.37和3.33±0.30(F=621.54，P<0.05)。骨折模型99Tcm-MDP显像示骨折处放射性摄取，99Tcm-DTPA-c(CGRRAGGSC)显像未见摄取。体内竞争抑制实验示未标记环九肽对瘤体显像具有抑制作用。
　　5.153Sm-DTPA-c(CGRRAGGSC)体外抑制实验：MTT法示A、B组未见细胞受到抑制，C、D组对细胞的抑制杀伤呈时间效应，各组药物作用48h后，通过亚G1峰检测PC-3细胞凋亡率分别为(0.98±0.18)％，(0.35±0.10)％，(4.05±0.28)％，(13.38±0.89)％，差异有统计学意义(F=953.60，P<0.05)。western blot表明B～D组IL11未见变化，IL11R表达D组比B、C组降低，干预后A值分别为(0.339±0.014)，(0.338±0.019)，(0.226～0.015)，差异有统计学意义(t=0.405、1.163、135.989，P<0.05)。Western blot结果显示随抑瘤作用增加，IL11R蛋白表达降低。
　　结论：1.IL11R可以作为前列腺癌骨转移治疗研究的有效靶点。
　　2.放射性标记探针具有良好的体内外生物学活性。标记物标记率高，稳定性好，通过尾静脉注射靶向性高，符合特异性配体的标准。
　　3.经尾静脉99Tcm-DTPA-c(CGRRAGGSC探针能靶向聚集在瘤体部位，是前列腺癌等富含IL-11R的骨转移特异分子靶向显像剂，可以作为检查肿瘤是否富含IL-11R的检查手段，以利进行治疗核素标记探针的个体化靶向治疗。
　　4.体外实验表明153Sm-DTPA-c(CGRRAGGSC)能够有效抑制PC-3细胞的生长并促进IL11R表达下调。有效抑制肿瘤细胞的生长，呈现剂量依赖关系，无明显毒副作用。