肾素-血管紧张素系统激活与脂代谢紊乱在肾损伤中的相互作用研究

摘要

目的:高血压和高脂血症是慢性肾脏病(choronic kidney disease，CKD)发生发展的独立危险因素，肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)激活是CKD肾性高血压发生的主要机制之一。研究表明，RAS激活与高脂血症在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)进展中存在相互作用。然而，脂代谢紊乱与RAS激活在介导肾脏损伤中是否存在相互作用及可能的机制如何，目前尚不清楚。本研究旨在通过体内、外实验，观察脂代谢紊乱与RAS激活在介导肾脏损伤中的作用，并探讨可能的作用机制。
　　 方法:将8周龄雄性载脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein Eknockout, ApoE-/-)小鼠随机分为高脂饮食组(n=8)和普通饮食对照组(n=8)，8周后处死小鼠收集血浆标本及肾脏组织标本，观察高脂血症对肾脏局部RAS激活的影响及其在肾损伤中的作用;体外研究，脂质刺激分别观察其对人近端肾小管上皮细胞(Human proximaltubular epithelial cell line，HK-2)和人肾小球系膜细胞（Human mesangial cell，HMC）胞内RAS的表达及其可能的作用机制;血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）刺激分别观察其对HK-2和HMC胞内脂质堆积及脂代谢信号通路的影响。放免法检测动物血浆中循环RAS水平，临床生化法检测血浆脂质谱，HE染色和Masson染色评估肾脏炎症细胞浸润及胞外基质堆积，MTT及流式细胞仪观察细胞生长及增殖情况，油红O染色及化学酶促-比色法观察胞内中脂质积聚情况，免疫组化、免疫荧光染色检测肾脏组织及细胞中蛋白表达，实时定量PCR及Western Blot法检测组织及细胞内RAS成分、上皮-间充质转分化相关因子E-cadherin，α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)和fibronectin、胞外基质、低密度脂蛋白受体(low densitylipoprotein receptor, LDLr)脂代谢信号通路以及雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target ofrapamycin, mTOR)信号通路相关因子表达。
　　 结果:1）与对照组比，高脂饮食组小鼠血脂水平明显升高，伴有肾小管间质胞外基质堆积增多。除血浆前肾素水平明显低于对照组外，其它指标，如血浆肾素、血管紧张素Ⅰ及AngⅡ水平两组间无明显差异。进一步研究显示，肾脏局部RAS成分蛋白表达均明显升高，与血脂水平呈正相关，与诱导肾脏细胞EMT呈正相关。2）脂质刺激HK-2、HMC后，胞内RAS成分表达明显增多，提示胞内RAS活化。同时，HK-2 E-cadherin mRNA及蛋白水平较对照组降低，而α-SMA和fibronectin水平较对照组升高，促进HMC增殖，胞外基质表达增加，提示细胞发生功能改变。进一步研究显示，胞内mTOR, S6k1和4EBP1基因的表达及磷酸化状态蛋白水平明显升高，提示mTOR信号通路激活可能参与了脂质刺激的细胞增殖。3）AngⅡ刺激后，HK-2及HMC胞内脂质积聚显著增加。并诱导HK-2发生上皮-间充质转分化，促进HMC增殖，胞外基质表达增加。同时，胞内LDLr，固醇调节元件结合蛋白-2(sterolregulatory element binding protein-2，SREBP-2)及SREBP裂解激活蛋白(SREBPcleavage-activating protein, SCAP)表达升高，激光共聚焦显微镜证实，AngⅡ能够刺激胞内SCAP/SREBP-2从内质网到高尔基体的共转位，进而上调LDLr基因转录，促进细胞增加胆固醇摄入。
　　 结论:脂代谢紊乱可诱导肾固有细胞表型转化，促进肾小管间质纤维化和肾系膜胞外基质分泌，该过程可能与肾脏局部RAS激活有关，其中mTOR信号通路可能在调节相关基因和蛋白表达中发挥了重要作用。另一方面，AngⅡ可通过破坏LDLr负反馈调节增加肾脏固有细胞内胆固醇摄入，促进脂质沉积，进而介导肾小球、肾小管细胞损伤。本研究阐明了肾脏局部RAS激活与脂代谢紊乱在肾脏损伤中的相互作用，为临床早期联合应用RAS抑制剂和调制药物防治慢性肾脏病提供了新的理论依据和思路。

目录

声明

摘要

缩略语注释表(Abbreviations)

绪论

参考文献

文献综述

常规实验方法技术

第一部分 肾脏局部肾素血管紧张素系统激活在载脂蛋白E基因敲除小鼠脂质肾损伤中的作用

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 结论

参考文献

第二部分 胞内肾素血管紧张素系统激活与脂代谢紊乱在肾小管上皮细胞损伤中的作用研究

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

第三部分 胞内肾素血管紧张素系统激活与脂代谢紊乱在肾小球系膜细胞损伤中的作用研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 结论

参考文献

全文总结与展望

致谢

作者简介

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