扩张型、肥厚型心肌病心肌重塑的蛋白质及信号通路研究

摘要

目的：本课题观察8例心脏扩张、心力衰竭进行心脏移植或心脏手术患者的左室心肌组织cTnI磷酸化、降解片段及PKC信号通路变化，经腹腔注射抗cTnI单克隆抗体以期制备出免疫性DCM小鼠模型，探讨cTnI磷酸化、降解及PKC信号通路调节在DCM发生、发展中的作用；研究cTnIR146W-EGFP突变小鼠重塑心肌组织以及缺血缺氧、异丙基肾上腺素干预培养SD乳鼠心肌细胞内cTnI磷酸化及降解作用、PKC信号通路的变化，以期在分子细胞学水平探讨cTnI磷酸化、降解以及PKC信号通路调节与DCM、HCM心肌重塑发生、发展的关系，试图阐述“肌丝重构”在心肌病发病机制中的作用，为临床诊断和治疗提供分子病理学理论基础。 内容与方法：1.4例DCM、3例其他病因致心室扩张进行心脏移植术受体心脏、1例行双瓣膜置换及左心室改良术，部分左室切除心肌组织，6例正常心脏，心肌病患者心肌组织行光镜、电镜病理学检测；左心室组织匀浆提取总蛋白，卡马斯亮蓝定量，定量后总蛋白分别用抗磷酸化、去磷酸化及不同表位的cTnI单克隆抗体、抗PKCβ1、PKCβ2、PKCγ单克隆抗体作为一抗、抗GAPDH单克隆抗体作为内参WesternBlotting方法检测磷酸化、去磷酸化cTnI、cTnI降解片段及PKC表达。 2.4周龄雌性BALB/c小鼠随机分为三组，于第0天、7天、21天、35天、49天、63天、77天分别腹腔注射2株抗cTnI单克隆抗体及IgG，观察小鼠生长情况。于停止免疫2月(小鼠25周龄)、4月(小鼠33周龄)行二维超声心动图检查，摘眼球取血处死，称取小鼠体重、心脏湿重，取心尖部横截面10﹪甲醛固定，HE染色，光镜下观察心肌病理改变。ELISA法测定血清cTnI，心肌组织匀浆提取总蛋白，卡马斯亮蓝定量后用抗磷酸化、去磷酸化及不同表位的cTnI单克隆抗体、抗PKCβ1、PKCβ2、PKCγ单克隆抗体作为一抗、抗GAPDH单克隆抗体作为内参WesternBlotting方法检测磷酸化、去磷酸化cTnI、cTnI降解片段及PKC表达。 3.含报告基因增强型绿色荧光蛋白EGFP-cTnIR146W突变基因的肥厚型心肌病模型小鼠6只(HCM组)，对照组小鼠6只(N组)，均为BALB/c小鼠，全雌性，20周龄时行二维超声心动图检查，摘眼球取血处死小鼠，摘取小鼠心脏后拍摄照片，称取小鼠心脏湿重、取心尖部横截面10﹪甲醛固定，HE染色，光镜下观察心肌病理改变；用抗EGFP单克隆抗体、抗cTnI单克隆抗体采用免疫组化法检测心肌组织内EGFP、cTnI表达；匀浆提取总蛋白，卡马斯亮蓝定量后用抗EGFP、抗磷酸化、去磷酸化及不同表位的cTnI单克隆抗体、作为一抗、抗PKCβ1、PKCβ2、PKCγ单克隆抗体作为一抗，抗GAPDH单克隆抗体作为内参WesternBlotting方法检测磷酸化、去磷酸化cTnI、cTnI降解片段及PKC表达。 4.培养SD乳鼠心肌细胞，用不同浓度ISO(10-4mol-L、10-5mol/L)及缺血缺氧干预2h、4h、6h，分别在光镜下观察各组心肌细胞的形态并记数一分钟内的心肌细胞搏动率，ELISA法测定各组培养心肌细胞上清cTnI的变化；RIPA细胞裂解提取胞浆蛋白，考马斯亮蓝法蛋白定量，用抗磷酸化、去磷酸化及不同表位的cTnI单克隆抗体、抗PKCβ1、PKCβ2、PKCγ单克隆抗体作为一抗、抗GAPDH单克隆抗体作为内参WesternBlotting方法检测磷酸化、去磷酸化cTnI、cTnI降解片段及PKC表达。 5.统计学方法：结果均以均数±标准差(x±SD)表示，QuantityOne4.5.2QuantitationSoftware(Bio-Rad，USA)软件半定量检测，SPSS13.0统计软件进行组间比较t检验，P＜0.05为有显著性差异。 结果：1.扩张型心肌病患者心肌组织cTnI降解片段WesternBlotting检测结果显示：4例DCM及4例其他心肌病患者心肌内抗cTnI单克隆抗体3E3、8I-7、MF4均检测到cTnI表达及降解片段，抗体2I-14检测在第四例心肌炎后心肌病患者心肌内检测到cTnI表达及降解条带，其他7例心肌病患者心肌内检测到cTnI表达但未见降解条带；6例正常心脏左室内均可见cTnI表达，未见降解条带。 2.扩张型心肌病患者心肌组织磷酸化、去磷酸化cTnI及PKCWesternBlotting检测结果：4例DCM患者、4例其他心肌病患者左室心肌组织在30kDa附近均有明显磷酸化cTnI表达，半定量结果均明显高于对照组(P＜0.05)，两组心肌病表达比较无显著性差异(P＞0.05)；4例DCM患者及4例其他心肌病患者左室心肌组织内均可见程度不同的去磷酸化cTnI表达，同时第四例心肌炎后心肌病患者左室心肌组织内出现强烈的去磷酸化cTnI表达，并出现明显降解条带，正常组左室心肌组织内未出现明显去磷酸化cTnI表达；抗PKCβ1、PKCβ2单克隆抗体在4例DCM患者、4例其他心肌病患者及正常对照组左室心肌组织内均未检测到明显的PKCβ1、PKCβ2表达。 3.抗cTnI单克隆抗体注射免疫小鼠心肌病理学检测未见心肌纤维排列紊乱、肌丝断裂、胶原纤维增生等扩张型心肌病改变，与正常对照组相比无明显区别，心脏二维超声心动图检查未见明显心腔扩大、心室壁变薄、收缩功能降低等扩张型心肌病改变，心脏湿重/体重比与正常组无显著差异(P＞0.05)，血清cTnI水平正常，与对照组无显著性差异(P＞0.05)。抗cTnI单克隆抗体注射免疫小鼠及对照组小鼠心肌组织内均可见明显磷酸化cTnI或较弱去磷酸化cTnI表达，在58kDa、28kDa附近均可见较弱PKCβ1、PKCβ2、PKCγ表达，半定量结果两组之间无显著性差异(P均＞0.05)；抗cTnI单克隆抗体3E3、2I-14、8I-7、MF4均检测到不同程度cTnI表达，比较无明显差异(P均＞0.05)，未见降解条带。 4.cTnIR146W-EGFP突变HCM小鼠20周时解剖发现心脏明显肥大，心脏湿重/体重比较正常组明显增高(P＜0.05)，二维超声心动图检测见HCM组小鼠室间隔明显肥厚，室间隔与左室后壁之比超过1.3，左室收缩末期内径小于正常组，左室EF值、FS无明显差异(P＞0.05)；病理学检查光镜下见心肌细胞肥大、排列紊乱，间质血管增生，少量炎性细胞浸润；免疫组化检测，在HCM小鼠和对照组小鼠心肌组织内均未检测到cTnI或EGFP表达。 5.cTnIR146W-EGFP突变HCM小鼠心肌组织及其它器官组织，分别应用抗EGFP及抗cTnI单克隆抗体WesternBlotting检测结果显示，在55kDa附近分别见与cTnIR146W-EGFP分子量(30kDa+26kDa)相符明显条带，在28kDa附近可见cTnIR146w-EGFP降解条带，正常对照组未见表达；在30kDa心肌组织抗cTnI单克隆抗体检测见cTnI表达，其余组织均未见cTnI表达。 6.cTnIR146W-EGFP突变HCM小鼠心肌组织在55kDa附近可见磷酸化、去磷酸化cTnIR146w-EGFP表达条带，在28kDa可见磷酸化、去磷酸化cTnI降解条带；在30kDa附近两组小鼠心肌组织均未见内源性去磷酸化cTnI表达，但可见明显内源性磷酸化cTnI表达，半定量检测结果显示HCM组明显高于正常对照组(P＜0.05)；HCM小鼠和正常对照组小鼠心肌组织均可见PKCβ1、PKCβ2、PKCγ表达，半定量检测结果显示HCM组明显高于对照组(P＜0.05～0.01)，HCM组PKCγ显著高于PKCβ1(P＜0.01)和PKCβ2(P＜0.05)，PKCβ1与PKCβ2之间比较无显著性差异(P＞0.05)，正常组PKCβ1、PKCβ2、PKCγ表达无显著性差异(P＞0.05)。 7.cTnIR146W-EGFP突变HCM小鼠心肌组织cTnI及降解片段westernBlotting检测结果显示：抗cTnI单克隆抗体(Clone3E3、2I-14、8I-7、MF4)在55kDa、30kDa附近均检测到cTnIR146W-EGFP、内源性cTnI表达，在28kDa可见cTnI降解条带，对照组在30kDa可见cTnI表达，未见降解条带；内源性cTnI表达半定量结果显示，HCM组抗体3E3检测明显高于对照组(P＜0.05)，抗体2I-14、8I-7、MF4检测两组之间无显著性差异(P＞0.05)。 8.与正常对照组比较，异丙基肾上腺素10-5mol/L、10-4mol/L干预培养SD大鼠心肌细胞72h后，培养上清cTnI的浓度显著高于对照组(P均＜0.01)，两组不同ISO浓度干预组之间比较无明显差异(P＞0.05)；缺血缺氧2h、4h、6h后，培养上清cTnI的浓度均显著高于对照组(P均＜0.01)；缺血缺氧6h组明显高于缺血缺氧2h组 (P＜0.05)，异丙基肾上腺素干预组培养上清cTnI的浓度均高于缺血缺氧干预组(P均＜0.05)。

目录

缩略语

引言

第一部分扩张型心肌病心肌肌钙蛋白I磷酸化、降解研究

第一节 扩张型心肌病患者心肌组织cTnI磷酸化及降解片段改变

第二节 免疫性扩张型心肌病小鼠模型建立及超声心动图检查结果

第三节 抗cTnI单克隆抗体注射免疫小鼠心肌内cTnI磷酸化及降解片段改变

第一部分小结

参考文献

第二部分肥厚型心肌病小鼠重塑心肌内肌钙蛋白I磷酸化、降解研究

第三部分缺血缺氧、异丙基肾上腺素损伤后心肌细胞cTnI磷酸化、降解的观察

附录

致谢

本论文受到以下项目及基金资助

综述心肌肌钙蛋白I的磷酸化与降解研究进展

本课题创新之处

论文独创性声明及论文使用授权声明和知识产权申明