小胶质细胞上ATP敏感性钾通道的表达及其对神经炎性反应的调节

摘要

帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)是常见的中枢神经系统慢性退行性疾病，临床主要表现为静止性震颤、运动徐缓、肌僵直以及平衡功能失调等症状，病情呈慢性进行性加重。在55岁以上人群中发病率约为2﹪，其中95﹪的病例为散发性。遗传因素和环境因素被认为是PD的主要致病因素，其典型病理和生化特征为黑质致密部多巴胺能神经元变性、缺失，Lewy's小体的出现及纹状体多巴胺(dopamine，DA)含量显著降低。但DA能神经元变性、死亡的机制还未阐明。目前认为氧化应激、兴奋性毒性、神经炎性反应和线粒体功能障碍等是导致DA能神经元死亡的主要机制。特别是脑内小胶质细胞活化所介导的神经炎性病理反应，是疾病发生的早期机制之一，并加重其他因素所导致的DA能神经元死亡，促进了疾病的发生发展。目前，临床主要应用L-DOPA替代治疗或DA受体激动剂改善PD症状。但这些药物并不能阻止疾病的进展，且长期使用易出现神经系统和心血管系统等严重不良反应。因此，进一步阐明PD的病因与发病机制、探索有效的PD治疗新靶标和治疗新药具有重大意义。包括本实验室在内的国内外研究表明，调节脑内小胶质细胞活化所介导的神经炎性病理反应是神经保护的重要新策略。 ATP敏感性钾通道(ATP-sensitivepotassiumchannel，KATP)是一种耦联细胞代谢和电活动、以细胞内的ATP/ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾离子通道。近年来，包括本实验室在内的研究表明：1)KATP特别是线粒体KATP(mitochondrialATP-sensitivepotassiumchannel，mito-KATP)是重要的神经保护靶标，不仅是急性缺血缺氧、氧化应激等病理因素所致损伤时的重要内源性保护机制，而且在神经元受损中、后期的神经炎性病理反应以及神经元凋亡中也发挥重要的保护作用；2)KATP与PD的发生、发展密切相关，是探讨PD发病机制和研发治疗药物的新靶标；3)KATP不仅直接对神经元发挥保护作用，而且能通过调节脑内星形胶质细胞和小胶质细胞功能发挥对神经元的进一步保护作用。新型KATP开放剂埃他卡林(iptakalim，IPT)是我国学者自行设计、合成的脂肪仲胺类小分子化合物，易透过血脑屏障，使得在整体水平上评价KATP开放剂的神经保护作用成为可能。本实验室前期研究显示，IPT不仅对急慢性脑缺血损伤具有确切的神经保护作用，而且对应用多种神经毒素如6-羟基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、鱼藤酮(rotenone，Rot)、N-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy-4-phenyl-2，3-dihydropyridiniumion，MPP+)等制备的PD整体动物模型和离体细胞模型均具有神经保护作用。然而，KATP除了直接保护神经元外，还可能通过调节星形胶质细胞和小胶质细胞功能发挥神经保护作用。本文旨在从离体和在体水平系统研究KATP对小胶质细胞活化的影响，阐明KATP对神经炎性反应的调节在其神经保护作用中的重要作用，也为将IPT发展为PD治疗新药积累必要的学术与实验基础。 本文工作第一部分首先鉴定了原代培养的大鼠小胶质细胞上KATP的表达，在此基础上研究KATP对rotenone诱导的小胶质细胞活化的调节及其机制；第二部分进一步从在体水平研究KATP对rotenone致PD模型大鼠脑内小胶质细胞活化介导的神经炎性反应的调节及其神经保护作用。 第一部分小胶质细胞上ATP敏感性钾通道的表达及其对小胶质细胞活化的调节 目的：研究原代培养的大鼠小胶质细胞是否表达KATP，在此基础上进一步研究KATP对rotenone诱导的小胶质细胞活化的调节作用及相关机制。 方法：应用westernblotting、RT-PCR法检测原代培养的大鼠小胶质细胞是否表达KATP；从形态学及免疫荧光细胞化学法检测小胶质细胞的活化；ELISA法检测细胞培养液中TNF-α的含量，放射免疫测定法(RIA)检测PGE2的含量；应用JC-1荧光探针检测小胶质细胞线粒体膜电位；Westernblotting检测小胶质细胞p38/JNKMAPK磷酸化水平。 结果：1)原代培养的大鼠小胶质细胞表达KATP，其亚基组成为Kir6.1、SUR2A/2B。2)rotenone(10nM)可显著诱导小胶质细胞活化，形态学上呈阿米巴样改变，ED1表达上调，致炎因子TNF-α和PGE2生成增加；10μMIPT或100μMdiazoxide预处理均能显著抑制小胶质细胞的活化，抑制ED1的表达与TNF-α和PGE2的生成增加。250μM的mito-KATP阻断剂5-HD可以取消IPT和diazoxide的上述效应。3)rotenone能诱导小胶质细胞线粒体膜电位水平下降，以及p38/JNKMAPK磷酸化水平增加；IPT或diazoxide能逆转rotenone的上述作用，5-HD可以取消IPT和diazoxide的上述作用。 结论：小胶质细胞表达KATP，其亚基组成为Kir6.1、SUR2A/R2B；KATP开放能抑制rotenone诱导的小胶质细胞活化及致炎因子生成增加，其作用机制与其稳定线粒体膜电位及抑制p38/JNK信号通路激活有关。 第二部分ATP敏感性钾通道对小胶质细胞介导的脑内神经炎性反应的调节 目的：研究KATP对rotenone致帕金森病模型大鼠脑内小胶质细胞活化及神经炎性病理反应的影响，进一步探讨KATP的神经保护作用及机制。 方法：1)动物给药处理：SD大鼠给予IPT(1.5或3.0mg·kg-1·day-1)或mito-KATP开放剂diazoxide(1.5mg·kg-1·day-1)连续灌胃三天，自第四天起，于每天IPT或diazoxide灌胃后1h背部皮下注射rotenone(2.5mg·kg-1·day-1)，连续给药4周，统计各组大鼠死亡率并进行行为学研究；2)免疫组织化学法检测脑内黑质部位DA能神经元存活情况(TH染色)，同时检测黑质部位小胶质细胞活化情况(OX-42和ED1染色)；3)RT-PCR法检测脑纹状体和黑质中TNF-α和COX-2mRNA表达水平变化。 结果：1)单独给予rotenone组大鼠死亡率明显增加至40﹪，前爪移动潜伏期均值延长至42s，提示大鼠出现明显的肌僵直症状；不同浓度IPT和diazoxide均可显著降低大鼠死亡率，缓解肌僵直症状。2)rotenone能显著诱导大鼠黑质DA能神经元变性死亡(TH阳性细胞数与对照组相比下降68.1﹪)，并伴随着小胶质细胞活化显著增加，以及TNF-α和COX-2mRNA表达水平增加。3)不同浓度IPT和diazoxide均可促进DA能神经元存活(TH阳性细胞数与对照组相比分别下降22.2﹪、15.8﹪和19.7﹪)，并抑制rotenone诱导的小胶质细胞活化及TNF-α和COX-2mRNA表达增加。 结论：系统给予KATP开放剂能显著缓解rotenone诱导的大鼠帕金森样症状，促进黑质DA能神经元存活；KATP开放剂的神经保护作用与其抑制小胶质细胞活化介导的神经炎性病理反应密切相关。本文工作的主要创新之处在于： 1.发现原代培养的大鼠小胶质细胞表达KATP，其亚基组成为Kir6.1和SUR2A/2B，并系统研究、阐明了KATP对小胶质细胞活化及神经炎性病理反应的调节作用及机制。 2.发现开放小胶质细胞上的KATP可通过抑制小胶质细胞活化及神经炎性病理反应发挥神经保护作用，其作用机制与其稳定线粒体膜电位及抑制p38/JNK信号通路激活有关。 3.本文研究结果为诸多神经炎性相关疾病的治疗提供了新的思路，也为将新型KATP开放剂IPT发展为治疗PD等神经炎性相关疾病的创新药物积累了必要的学术与实验基础。

目录

英文缩略词表

前 言

第一部分小胶质细胞上ATP敏感性钾通道的表达及其对小胶质细胞活化的调节

第二部分ATP敏感性钾通道对小胶质细胞介导的脑内神经炎性反应的调节

结 语

参考文献

附录在读期间发表或已完成的论文

综 述神经炎性反应与帕金森病

致 谢

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