新型牙根尖充填材料的制备及性能研究

摘要

牙根尖充填材料种类众多，形式各样，但均具有一定缺陷。理想的牙根尖充填材料应具有良好的封闭性、无毒性及致癌性、体积稳定、不受潮湿等因素影响、X射线阻射、易于临床操作、抑菌性能及生物相容性良好等。到目前为止，还没有一种牙根尖充填材料能达到上述全部要求。因此，研制一种理想的新型牙根尖充填材料具有十分重要的临床意义及应用前景。
　　羟基磷灰石是人体骨骼及牙齿等硬组织主要成分之一，具有优良的生物活性及生物相容性，因而被广泛应用于齿科材料。但羟基磷灰石粉体在手术后易移位、机械及成形能力性能差等缺点限制了其作为人工骨及齿科材料的应用。磷酸钙骨水泥是一种自固化非陶瓷羟基磷灰石类骨修复材料，能在人体生理环境下发生水化固化反应，生成羟基磷灰石，具有良好的生物相容性及骨传导性能。但其固化时间长、抗压强度低、固化早期与水或血液接触易于崩解等缺点限制了其在根管外科手术中的临床应用。为了克服上述材料的缺点，本论文首次将天然羟基磷灰石、磷酸四钙、聚丙烯酸、柠檬酸、柠檬酸钠及氧化锆等材料复合，研制出一种新型牙根尖充填材料。该材料具有良好的理化性能及生物相容性，有望成为理想的牙根尖充填材料。本论文主要包括以下几个方面的工作:
　　1、天然羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸复合材料的制备、表征及其性能研究
　　首次采用质量比为43.5％天然羟基磷灰石，43.5％磷酸四钙、8.7％聚丙烯酸、2.15％柠檬酸及2.15％柠檬酸钠为粉体，液剂为蒸馏水，按粉液比为5∶1进行调拌，制备出天然羟基磷灰石/磷酸四钙/聚丙烯酸复合材料（NHA/TTCP/PAA）。该材料的X射线衍射(XRD）、扫描电镜(SEM)及傅里叶红外光谱(FTIR)表征结果显示，其主要成分为羟基磷灰石及羧酸钙盐。理化性能检测结果显示:NHA/TTCP/PAA调拌时呈面团状，具有优良的操作性能;固化时间为11.03±0.78min;固化1d及7d的抗压强度分别为25.58±2.68MPa及38.21±5.72MPa; pH值介于6.13～8.37之间，24h后即呈弱碱性;孔隙率为13.91％;溶解度为介于1.28％～1.33％;在磷酸缓冲液(PBS)中不会被崩解，具有良好的抗稀散性能;接触角为54.33°±8.99°，亲水性良好;但其X射线阻射值较低，仅等效于1.11±0.05mm的纯铝，不符合ISO6876∶2001相关标准。细胞相容性研究结果显示，该材料的细胞毒性分级为0级或Ⅰ级，符合GB/T16886.5-2003标准，均为合格。因此，NHA/TTCP/PAA具有良好的理化性能及细胞相容性，临床应用前景良好。
　　2、基于NHA/TTCP/PAA的新型牙根尖充填材料制备、表征及其性能研究
　　在NHA/TTCP/PAA粉体中分别添加20％氧化锆、氧化铋及硫酸钡等X射线阻射剂，制备出三种含X射线阻射剂NHA/TTCP/PAA材料，即含氧化锆NHA/TTCP/PAA(NHA/TTCP/PAA-Zr)、含氧化铋NHA/TTCP/PAA(NHA/TTCP/PAA-Bi)及含硫酸钡NHA/TTCP/PAA(NHA/TTCP/PAA-Ba)。含X射线阻射剂NHA/TTCP/PAA材料的XRD、SEM及FTIR表征结果显示，其主要成分为羟基磷灰石、羧酸钙盐及其所含的X射线阻射剂。理化性能检测结果显示:该类材料除具有NHA/TTCP/PAA相似的理化性能外，NHA/TTCP/PAA-Bi及NHA/TTCP/PAA-Zr的X射线阻射值分别等效于5.22±0.23mm及3.63±0.22mm纯铝，达到ISO6876∶2001相关标准要求;7d组的抗压强度分别为53.28±2.78MPa及62.19±8.87MPa，显著大于NHA/TTCP/PAA的抗压强度(P＜0.05)。细胞相容性研究结果显示:新鲜材料组（固化10min）及固化组（固化24h）含X射线阻射剂NHA/TTCP/PAA材料的细胞毒性分级为0级或Ⅰ级，符合GB/T16886.5-2003标准，均为合格;在所有测试的材料中，NHA/TTCP/PAA-Zr的细胞毒性最小。鉴于NHA/TTCP/PAA-Zr具有更好的理化性能及细胞相容性，本论文将其确定为新型牙根尖充填材料(NRFM)。
　　3、NRFM、MTA及GIC三种牙根尖充填材料的封闭性能对比研究
　　牙根尖充填材料的封闭性能是影响根管外科手术成功关键因素之一。本论文通过建立人离体牙根管及模拟根管的微渗漏模型，采用染色法对NRFM、MTA及GIC三种牙根尖充填材料的封闭性进行对比研究。研究结果显示:MTA的微渗漏最小，NRFM次之，GIC的微渗漏最大，差别具有统计学意义（P＜0.05）。利用SEM检测材料与人离体牙根管边缘适合性，结果显示，MTA及NRFM的边缘适合性好，GIC的边缘适合性差。
　　4、NRFM、MTA及GIC三种牙根尖充填材料的生物相容性对比研究
　　由于牙根尖充填材料直接与根尖周围组织相接触，生物相容性是其最重要的性能之一。本论文从整体水平及细胞水平对NRFM、MTA及GIC三种牙根尖充填材料的生物相容性进行研究。
　　1)采用SD大鼠皮下植入实验检测NRFM、MTA及GIC三种牙根尖充填材料对皮下结缔组织反应性，结果显示:术后1w，所有实验材料组的皮下组织均产生较为严重的炎症反应，但随着植入时间的延长，实验组及对照组的皮下组织炎症反应均较术后1w组显著减轻。NRFM组与阴性对照组相似，炎症反应最轻;MTA及GIC组虽然炎症反应减轻，但在材料植入12w后，仍有一些炎症细胞浸润，其炎症反应程度及范围均较NRFM严重(P＜0.05)。上述三种牙根尖充填材料中，NRFM的组织相容性最佳。
　　2)采用Transwell小室系统检测了NRFM、MTA及GIC三种牙根尖充填材料对人成骨肉瘤细胞（MG-63细胞）的增殖与分化作用的影响，结果显示:与阴性对照组相比，NRFM对MG-63细胞无明显抑制作用，且能显著促进5d及7d组细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性(P＜0.05);MTA组对5d及7d组的MG-63细胞有显著抑制作用，但能显著促进ALP的活性(P＜0.05);与NRFM及MTA不同，GIC组不仅对5d组的MG-63细胞有显著抑制作用，而且能显著抑制3d、5d及7d组的ALP活性(P＜0.05)。在这三种材料中，NRFM细胞毒性最小，且有促进MG-63细胞向成骨细胞分化作用。
　　5、NRFM、MTA及GIC三种牙根尖充填材料对MG-63细胞成骨分化的分子机理研究
　　本论文采用基因表达谱芯片检测了与NRFM、MTA及GIC三种牙根尖充填材料共培养5d后MG-63细胞的基因表达，研究结果显示:NRFM组有2950个、MTA有2273个及GIC组有404个基因发生差异表达(P＜0.05)。采用DAVID在线数据库对3种材料的差异表达基因进行GO功能分类分析，结果显示:NRFM组、MTA组及GIC组的差异表达基因分别影响6个、5个和1个与成骨分化相关的功能类别;NRFM组还影响2个与成牙相关的功能类别。差异表达基因参与的生物学通路分析结果显示:NRFM和MTA组诱导MG-63细胞向成骨细胞的分化与PI3K-AKT信号通路和MAPK信号通路相关，而GIC组仅与PI3K-AKT信号通路相关。实时定量PCR实验结果显示:待验证的6个与成骨分化相关基因的差异表达值与其基因表达谱芯片结果基本相吻合，说明基因表达谱芯片实验结果具有良好的可靠性和重复性。
　　本论文研制的NRFM，主要成分为羟基磷灰石、羧酸钙盐及氧化锆等。与MTA及GIC等材料相比，NRFM具有适宜的固化时间、pH值、良好的抗稀散性能等理化性能及良好的生物相容性，并能诱导MG-63细胞向成骨细胞分化。因此，NRFM有望成为一种理想的新型牙根尖充填材料。

目录

声明

摘要

英文缩写词表

第一章 绪论

1．1 前言

1．2 牙根尖充填材料的种类及应用现状

1．2．1 银汞合金

1．2．2 氧化锌丁香油水门汀

1．2．3 玻璃离子水门汀

1．2．4 复合树脂

1．2．5 三氧化矿物凝聚体

1．3 牙根尖充填材料的生物相容性研究

1．3．1 牙根尖充填材料生物相容性的整体水平评价

1．3．2 牙根尖充填材料生物相容性的细胞水平评价

1．3．3 牙根尖充填材料生物相容性的分子水平评价

1．4 牙根尖充填材料的微渗漏研究

1．4．1 染色法

1．4．2 液体滤过(传输)法

1．4．3 放射性同位素示踪法

1．4．4 电化学法

1．4．5 扫描电镜(SEM)直接观察法

1．4．6 葡萄糖定量分析法

1．4．7 细菌或内毒素渗透法

1．5 论文选题及主要研究内容

参考文献

第二章 NHA／TTCP／PAA的制备、表征及其性能研究

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 材料和仪器

2．2．2 天然羟基磷灰石粉体的制备及其表征

2．2．3 NHA／TTCP／PAA的制备及表征

2．2．4 NHA／TTCP／PAA的理化性能

2．2．5 NHA／IWCP／PAA的细胞相容性实验

2．2．6 统计分析

2．3 结果

2．3．1 天然羟基磷灰石粉体的制备及其表征

2．3．2 NHA／TTCP／PAA的表征结果

2．3．3 NHA／TTCP／PAA的理化性能

2．3．4 NHA／TTCP／PAA的细胞相容性实验结果

2．4 讨论

2．4．1 天然羟基磷灰石粉体的制备及其表征

2．4．2 NHA／TTCP／PAA的制备及表征

2．4．3 NHA／TTCP／PAA的理化性能

2．4．4 NHA／TTCP／PAA的细胞相容性

2．5 本章小结

参考文献

第三章 新型牙根尖充填材料的制备、表征及性能研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料和仪器

3．2．2 含X射线阻射剂NHA／TTCP／PAA等材料的制备及表征

3．2．3 含X射线阻射剂NHA／TTCP／PAA等材料的理化性能

3．2．4 含X射线阻射剂NHA／TTCP／PAA等材料的细胞相容性研究

3．2．5 统计学处理

3．3 结果

3．3．1 含X射线阻射剂NHA／TTCP／PAA等材料的表征

3．3．2 含X射线阻射剂NHA／TTCP／PAA等材料的理化性能

3．3．3 含X射线阻射剂NHA／TTCP／PAA等材料的细胞相容性

3．4 讨论

3．4．1 含X射线阻射剂NHA／TTCP／PAA等材料的制备及表征

3．4．2 含X射线阻射剂NHA／TTCP／PAA等材料的理化性能

3．4．3 含X射线阻射剂NHA／TTCP／PAA等材料的细胞相容性

3．5 本章小结

参考文献

第四章 新型牙根尖充填材料的封闭性研究

4．1 前言

4．2 材料和方法

4．2．1 实验材料和仪器

4．2．2 染色法检测NRFM、MTA及GIC三种材料对人离体牙微渗漏的影响

4．2．3 染色法检测NRFM、MTA及GIC三种材料对模拟根管微渗漏的影响

4．2．4 SEM检测材料与人离体牙边缘封闭性

4．2．5 统计学处理

4．3 结果

4．3．1 离体牙染色法检测实验结果

4．2．2 模拟根管染色染色法检测实验结果

4．2．3 SEM检测实验结果

4．4 讨论

4．5 本章小结

参考文献

第五章 新型牙根尖充填材料的皮下植入实验

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 材料和仪器

5．2．2 NRFM、MTA及GIC三种牙根尖充填材料的皮下植入实验

5．2．3 生物反应评价

5．2．4 统计学处理

5．3 结果

5．3．1 材料皮下植入实验的大体观察实验结果

5．3．2 材料皮下植入实验的组织学观察实验结果

5．4 讨论

5．5 本章小结

参考文献

第六章 新型牙根尖充填材料对人成骨肉瘤MG-63细胞的增殖与分化研究

6．1 前言

6．2 材料和方法

6．2．1 实验材料和仪器

6．2．2 NRFM、MTA及GIC三种牙根尖充填材料对MG-63细胞相容性研究

6．2．3 MG-63细胞在NRFM、MTA及GIC三种材料表面生长的检测

6．2．4 NRFM、MTA及GIC三种材料浸提液钙离子浓度的检测

6．2．5 酶动力学检测ALP活性、细胞总蛋白含量测定

6．2．6 茜素红染色检测

6．2．7 统计学处理

6．3 结果

6．3．1 MTT比色法检测NRFM、MTA及GIC三种牙根尖充填材料的细胞毒性实验结果

6．3．2 MG-63细胞在NRFM、MTA及GIC三种材料表面粘附生长的检测结果

6．3．3 NRFM、MTA及GIC三种等材料浸提液钙离子浓度检测结果

6．3．4 碱性磷酸酶活性

6．3．5 茜素红染色实验结果

6．4 讨论

6．5 本章小结

参考文献

第七章 新型牙根尖充填材料对人成骨肉瘤MG-63细胞分化影响的基因表达谱分析

7．1 前言

7．2 材料和方法

7．2．1 实验材料和仪器

7．2．2 RFM、MTA及GIC三种牙根尖充填材料与MG-63细胞共培养体系的建立

7．2．3 总RNA的提取及质量评估

7．2．4 基因表达谱芯片实验

7．2．5 qRT-PCR验证实验

7．2．6 生物信息学分析

7．2．7 统计分析

7．3 结果与讨论

7．3．1 总RNA的纯度和质量检测结果与讨论

7．3．2 基因表达谱芯片实验结果与讨论

7．3．3 qRT-PCR验证实验结果与讨论

7．3．4 差异表达基因的生物信息学分析结果

7．4 本章小结

参考文献

第八章 总结与展望

8．1 全文总结

8．2 创新点

8．3 展望

在校期间发表论文情况

在校期间获得的专利授权

致谢