EGCG对急性UVB辐射后表皮角质形成细胞的保护机制探讨及对慢性UVA辐射后小鼠皮肤光老化的防护作用

摘要

EGCG对急性UVB照射HaCaT细胞保护机制的探讨研究背景： 日光中的长波紫外线(UVA)和中波紫外线(UVB)辐射可引起急性损伤如日晒伤和慢性累积性损伤如光老化及皮肤癌，对人类健康构成潜在危害。波长短能量较高的UVB(290-320nm)主要作用于表皮，角质形成细胞是其靶细胞，可诱导皮肤不良反应如红斑、水肿、水疱、皮肤色素沉着、异常增生、光老化和非黑色素皮肤癌，而机体通过多种保护性措施如凋亡和炎症来保护皮肤监视及对抗潜在致癌细胞的增殖。 近几年紫外线诱导的炎症反应和细胞恶性转化过程中信号通路的作用受到广泛关注，其中一个研究热点即是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路，该途径可被紫外线激活，故在调节紫外线诱导的多重细胞反应中至关重要。MAPK主要由以下四个家族组成：ERK,JNK,p38和ERK5/BMK1，其中p38介导的炎症反应和凋亡在维护表皮完整性和对抗紫外线诱导的肿瘤效应方面具有重要作用。 绿茶是全球广泛受欢迎的饮料，绿茶中的酚类是儿茶素，其中的没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是有效的自由基清除剂和抗氧化剂，可以预防化学致癌作用和紫外线诱导的氧化应激效应。我们以前的研究证实单次UVB辐射可引起急性光损伤包括细胞活性减低及增殖减慢、细胞凋亡增加、光加合物形成增多。累积性UVA/UVB照射甚至可以导致DNA突变及皮肤癌发生，当加入EGCG干预后，均可以减少UVB照射所致上述各种损伤性改变，但关于p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号途径在UVB所致凋亡及炎症中的作用，及其EGCG的保护机制是否也与此途径有关在国内尚未见报告，因此我们以人皮肤角质形成细胞株HaCaT为观察对象，研究p38MAPK途径在UVB照射诱导的细胞凋亡及炎症介质分泌活动中的作用，并以p38抑制剂为阳性参照对比观察EGCG的干预保护作用是否也与p38MAPK通路有关。 目的：第一部分研究UVB辐射引起HaCaT细胞发生凋亡的概率、细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌及p38MAPK和磷化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)的表达，探讨凋亡、细胞因子分泌与p38MAPK之间的联系，确定p38MAPK信号转导途径是否参与了UVB诱导的细胞凋亡及细胞因子的分泌。第二部分研究EGCG对UVB辐射后细胞凋亡、细胞因子分泌及p38MAPK、p-p38MAPK表达的影响，探讨EGCG的光保护机制是否也与p38MAPK通路有关。 方法：使用0,20，30，40，60，70及90mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后0h，1h，2h，3h，4h，6h，24h及48h收集细胞和上清。流式细胞仪检测细胞周期和凋亡；ELISA检测上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平；WestemBlot方法检测p38MAPK和p-p38MAPK的表达。 结果：①与空白对照组细胞凋亡率(O)相比，30mJ/cm2UVB照射后24h，HaCaT细胞凋亡率为21.25±0.33％，应用p38抑制剂后测细胞凋亡率降为10.14±0.27％，较UVB组降低1/2。②30mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后HacaT细胞分泌TNF-α渐增加，24h达高峰，后渐下降，p38抑制剂SB203580完全抑制TNF-α的分泌。UVB辐射后IL-1β，IL-6则随孵育时间而大幅度增加，SB203580明显抑制了IL-1β和IL-6的分泌水平。③不同剂量UVB照射后可激活HaCaT细胞p38MAPK途径，磷酸化p-p38水平增高，照光组与非照光组间相比具有统计学意义。以30mJ/cm2UVB照射时p-p38表达量最高，但非磷酸化p38表达量没有类似明显变化。以上数据说明急性UVB照射后p38MAPK途径的激活、细胞因子的分泌及凋亡细胞的增加之间存在时间先后上的调控关系，即p38MAPK信号通路中p38的快速磷酸化参与调控了后续的细胞因子的分泌活动及其由炎症介质介导的细胞凋亡作用。另外本实验结果显示p38抑制剂不能抑制UVB对p38磷酸化的诱导作用。④应用EGCG后细胞凋亡率降为6.63±7.5％，同时加入EGCG能部分抑制p-p38MAPK的表达以及TNF-α、IL-1β)IL-6的分泌。 结论：UVB辐射对HaCaT细胞具有明显的损伤作用；UVB可以通过激活p38MAPK途径和p38磷酸化，以促进炎症因子分泌增加而诱导HaCaT细胞凋亡。加用EGCG干预处理可抑制p38MAPK途径活化和炎症因子分泌活动，从而减少了UVB诱导的细胞凋亡，发挥了EGCG抵抗UVB急性损伤的功效。

目录

论文说明：中英文对照及缩略语(Abbreviations)

声明

全文技术流程图

第一部分：P38丝裂原活化蛋白激酶在UVB诱导HaCaT凋亡中的作用

第一节 摘要

第二节导言

第三节材料和方法

第三节结果

第四节分析和讨论

参考文献：

第二部分EGCG对UVB辐射后p38MAPK信号激活及炎症因子分泌的影响

第一节 摘要

第二节导言

第三节材料和方法

第四节结果

第五节分析和讨论

参考文献：

第三部分EGCG对慢性UVB辐射后小鼠皮肤光老化的防护作用

第一节 摘要

第二节导言

第三节材料和方法

结果

分析与讨论

参考文献：

全文小结

致谢

附录

综述：角质形成细胞的凋亡失调及相关皮肤病