候选抑癌基因ING4对人乳腺癌MCF-7细胞增殖能力的影响

摘要

肿瘤的发生、发展是在多因素相互作用下，经多阶段、多步骤而发生的一系列复杂过程。其中，抑癌基因的功能失活是肿瘤发生发展的最主要原因之一。因此，检测抑癌基因的表达及功能，对阐明肿瘤的发生发展规律、评价预后以及制定治疗方案等都具有极其重要的意义。生长抑制因子(the inhibitor of growth，ING)家族是一个抑癌基因家族，ING4是其新近发现的家族成员，该基因在结构上与其他ING家族成员高度同源，都具有核定位序列NLS和能使染色体结构发生重建的PHD模序[1]研究发现，ING4的表达异常与胶质细胞瘤[2]等多种肿瘤密切相关。Suwon Kim[3]等用比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)的方法检测到人乳腺癌细胞系和原发性乳腺癌组织的基因组中均存在ING4基因的缺失。以上研究结果提示ING4可能与乳腺癌的发生发展具有一定的相关性。但是迄今为止，有关ING4基因如何抑制乳腺细胞的恶性转化还不十分清楚。本研究拟通过免疫组织化学的方法检测ING4蛋白在乳腺癌组织中的表达情况，并通过构建重组真核表达载体pcDNA3.1/ING4，将其转染乳腺癌MCF-7细胞，以观察ING4对MCF-7细胞增殖的影响，从而进一步探讨该基因在乳腺癌发生发展中的作用，为临床治疗乳腺癌寻找新靶点奠定理论和实验基础。 目的：探索候选抑癌基因ING4蛋白的表达缺失与乳腺癌发生的关系；研究ING4基因对乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用，并初步探讨可能的作用机制。 方法：(1)采用SABC免疫组化法检测28例乳腺癌组织与27例良性乳腺增生组织中ING4蛋白的表达情况，并分析其与病理特征的关系。(2)构建真核表达载体pcDNA3.1/ING4，采用脂质体法将其转染到人乳腺癌细胞MCF-7中，以空白组和转染空载体组作为对照，MTT法检测细胞增殖活性，绘制细胞生长曲线；流式细胞术观察细胞周期的变化；通过G418筛选出稳定转染细胞株，并用Western blot方法分析其ING4蛋白的表达情况；通过平板克隆实验和撤血清诱导细胞凋亡实验进一步分析ING4对MCF-7细胞增殖能力和凋亡的影响；以及通过荧光实时定量PCR从mRNA水平检测重组表达载体转染前后p53，p21与6ax基因mRNA的表达变化。 结果：(1)27例良性乳腺增生组织中100％表达ING4蛋白，而28例乳腺癌组织中有6例ING4蛋白表达缺失，表达缺失率为22.2％。乳腺癌组织与良性乳腺增生组织中ING4蛋白的表达有明显的统计学差异(P<0.05)。(2)成功构建了重组真核表达载体pcDNA3.1/ING4；将其转染MCF-7细胞后，与空白组和空载体组相比，细胞生长速度明显减慢，细胞周期中G1期比例增加，S期比例减少，克隆形成能力减弱，撤血清诱导的细胞凋亡率明显升高。pcDNA3.1/ING4转染MCF-7后，实时定量PCR结果显示p21和bax的mRNA表达水平增高(P<0.05)，而p53的mRNA表达未见明显变化(P>0.05)。 结论：ING4蛋白表达缺失与乳腺癌的发生具有一定的相关性；高表达ING4基因能够抑制人乳腺癌细胞MCF-7的恶性增殖，促进细胞凋亡，其作用机制可能与p21和bax表达上调有关。 [

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结 果

讨 论

参考文献

小 结

致 谢

综 述:ING4基因的研究进展

附 录：就读期间发表文章