姜黄素对肺癌相关因子EGFR、UBE1L和RARβ调节作用机制研究

摘要

第一部分:UBE1L在姜黄素下调EGFR中的作用及机制 目的:探讨姜黄素诱导的类泛素激活酶E1(UBE1L)下调表皮生长因子受体(EGFR)的机制。 方法:免疫印迹检测细胞和肺癌组织中蛋白表达;反转录酶-聚合酶链锁反应检测UBE1L和EGFR的mRNA;免疫共沉淀检测EGFR和ISG15的结合;流式细胞术和细胞免疫荧光检测EGFR膜内化。 结果:在人支气管上皮细胞系Beas-2B细胞和人肺腺癌A549细胞中，证实姜黄素可以下调EGFR蛋白表达水平。在Beas-2B细胞中，首次发现姜黄素可以诱导UBE1L的表达。在Beas-2B细胞中，过表达UBE1L降低EGFR的蛋白水平。UBE1L不仅促进EGFR膜内化，还促进EGFR和ISG15复合物的形成。姜黄素下调EGFR下游信号蛋白p-AKT和NF-κB。在Beas-2B细胞中，过表达或者低表达UBE1L，相应的下调或者上调PI3K/AKT/NF-κB。在非小细胞肺癌组织和癌旁组织中，UBE1L和EGFR-AKT-NF-κB的表达存在着相反的关系。 结论:以上结果揭示姜黄素新的化学预防机制，在人支气管上皮细胞系Beas-2B细胞中姜黄素通过诱导UBE1L下调EGFR的信号通路。 第二部分:姜黄素等植物多酚对UBE1L的分子调节机制 目的:姜黄素、EGCG、白藜芦醇对类泛素激活酶E1(UBE1L)双向调节机制的研究。 方法:免疫印迹检测细胞中类泛素激活酶E1(UBE1L)、p-JNK、JNK、Nrf2蛋白表达;反转录酶-聚合酶链锁反应检测UBE1L的mRNA水平;流式细胞术检测人支气管上皮细胞中ROS的变化。 结果:在人支气管上皮细胞Beas-2B细胞中，低浓度的姜黄素、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、白藜芦醇诱导UBE1L的蛋白表达，而高浓度的姜黄素、EGCG、白藜芦醇则抑制UBE1L的蛋白表达。已知多酚类在低浓度时表现出抗氧化特性，而在高浓度时表现出促氧化性质。实验结果证明低浓度的姜黄素、EGCG、白藜芦醇使细胞内ROS水平降低，而高浓度的姜黄素、EGCG、白藜芦醇使细胞内ROS水平升高。为了验证ROS参与多酚调节UBE1L的表达，分别用抗氧化剂NAC，氧化剂H2O2和tBHP处理细胞。抗氧化剂NAC诱导UBE1L蛋白表达上调，而氧化剂H2O2和tBHP使UBE1L蛋白表达下调。姜黄素和NAC联用比姜黄素和NAC单独处理细胞诱导UBE1L作用增强，而姜黄素可以部分逆转tBHP引起的UBE1L的下调。MAPK抑制剂处理细胞，发现只有抑制JNK可以下调UBE1L的表达。不同浓度的姜黄素、EGCG、白藜芦醇处理Beas-2B细胞，发现低浓度的姜黄素、EGCG、白藜芦醇诱导p-JNK表达，而高浓度的姜黄素、EGCG、白藜芦醇下调p-JNK表达。当siRNA敲减Nrf2，UBE1L蛋白表达下降。 结论:不同浓度的多酚通过JNK/Nrf2/ROS通路对UBE1L双向调节。 第三部分:姜黄素介导的去甲基化在激活RARβ的作用及其机制 目的:研究姜黄素激活RARβ的表达的机制研究。 方法:免疫印迹检测细胞和肺癌组织中RARβ蛋白表达;反转录酶-聚合酶链锁反应检测RARβ的mRNA;甲基化特异性-聚合酶链锁反应检测RARβ启动子区甲基化水平。 结果:RARβ在肺癌组织和肺癌细胞中低表达。姜黄素和DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-dC诱导肺癌细胞A549和H460细胞中RARβ的蛋白和mRNA表达上升。姜黄素和5-Aza-dC使肺癌细胞A549和H460细胞中RARβ启动子区甲基化水平降低。在其他检测的细胞中姜黄素也可以诱导RARβ的蛋白水平。姜黄素抑制DNA甲基转移酶3b的mRNA水平。 结论:姜黄素通过抑制DNA甲基转移酶3b，使RARβ启动子区甲基化水平降低，激活RARβ的表达。为姜黄素作为肺癌的化学预防提供新的分子机制。

目录

声明

主要缩略词中英文对照

绪言

第一部分：UBE1L在姜黄素下调EGFR中的作用及机制

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分：姜黄素等植物多酚对UBE1L的分子调节机制

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分：姜黄素介导的去甲基化在激活RARβ的作用及其机制

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

创新点及进一步科研设想

姜黄素抗癌机制研究进展

附录

致谢