前列腺素EP3受体剪接体亚型在胆管细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用以及上调β-Catenin蛋白表达的分子机制研究

摘要

研究背景:
　　前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)是环加氧酶COX-2转化花生四烯酸的产物，是一种炎性介质，可促进多种肿瘤细胞的生长与侵袭，其中包括胆管细胞癌。PGE2可以与四种EP受体(E prostanoid receptor，EPR)结合，分别为EP1，EP2，EP3和EP4受体，从而影响着肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。EP3受体有EP3-4，EP3-5，EP3-6，EP3-7和EP3-85种剪接体亚型。我们前期的研究发现胆管细胞癌细胞系CCLP1和HuCCT1细胞主要表达EP3-4，EP3-5，EP3-6和EP3-7四种EP3受体亚型。然而对于通过EP3受体各亚型影响胆管细胞癌的生物学行为的作用和具体机制尚不清楚。
　　β-Catenin是粘连蛋白的一种，主要介导细胞的粘附，并在肿瘤发生发展过程中起着重要的作用。本课题组的前期研究结果表明，PGE2通过EP3受体可以显著地增强胆管细胞癌细胞的增殖与侵袭能力，在此工作基础上，我们进一步分析了EP3受体亚型在胆管细胞癌中的作用以及PGE2促进胆管细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的分子机制。
　　研究目的:
　　1.阐明EP3-4、EP3-5、EP3-6和EP3-7受体在胆管细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。
　　2.阐明PGE2通过EP3-4受体上调β-Catenin蛋白的相关机制与信号转导通路。
　　研究内容:
　　1.在胆管细胞癌CCLP1、HuCCT1细胞和HEK293T细胞中，过表达转染EP3-4， EP3-5，EP3-6和EP3-7受体亚型。
　　2.研究EP3-4，EP3-5，EP3-6和EP3-7受体亚型过表达，在促进胆管细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。
　　3.研究PGE2通过EP3-4受体上调β-Catenin蛋白的信号转导通路及相关机制。
　　研究方法:
　　1.运用常规细胞培养方法，培养胆管细胞癌细胞系CCLP1、HuCCT1细胞和人胚肾细胞HEK293T细胞。
　　2.应用Real-time PCR实验分析转染EP3受体细胞以及其通路中相关蛋白的mRNA水平的变化。
　　3.运用Western blot实验检测细胞过表达转染EP3-4，EP3-5，EP3-6和EP3-7受体亚型的转染效率。
　　4.运用WST实验，检测EP3受体激动剂(sulprostone)对过表达转染EP3-4，EP3-5，EP3-6和EP3-7受体的CCLP1、HuCCT1和HEK293T细胞增殖能力的影响。
　　5.运用Transwell实验检测sulprostone对过表达转染EP3-4，EP3-5，EP3-6和EP3-7受体的CCLP1、HuCCT1和HEK293T细胞迁移和侵袭能力的影响。
　　6.对信号转导通路中的一些关键靶点，采用化学抑制的方法，结合Western blot等实验结果分析信号转导通路。
　　研究结果:
　　1.在空载质粒对照转染、过表达转染EP3-4、EP3-5、EP3-6和EP3-7受体的CCLP1细胞系中，sulprostone上调细胞增殖能力分别至122％，145％，136％，120％和97％，上调细胞迁移能力分别至149％，224％，193％，138％，101％，上调细胞侵袭能力分别至129％，204％，193％，120％，96％。在HuCCT1和HEK293T细胞也见到类似的结果。
　　2.以空载质粒转染的CCLP1细胞为对照，在过表达转染EP3-4，EP3-5，EP3-6和EP3-7受体的CCLP1细胞系中，β-Catenin蛋白水平的表达分别为上升至134％，126％，102％，103％。在空载质粒转染和过表达转染EP3-4受体的CCLP1细胞中，PGE2诱导的β-Catenin蛋白水平上调分别为143％和193％，sulprostone诱导的β-Catenin蛋白水平上调分别为140％和218％。在HuCCT1细胞中也见到类似的结果。EP3受体阻断剂L798106处理可明显抑制PGE2诱导的β-Catenin蛋白水平表达。
　　3.sulprostone诱导过表达转染EP3-4受体的CCLP1细胞c-Myc和Snail mRNA上调水平分别为252％和206％，诱导c-Myc和Snail蛋白表达水平分别上调为208％和180％。
　　4.sulprostone对过表达转染EP3-4受体的CCLP1细胞β-Catenin mRNA水平无明显改变，使β-Catenin磷酸化水平下降到40％。
　　5.在过表达转染EP3-4受体的CCLP1、HuCCT1和HEK293T细胞中，sulprostone上调GSK-3β蛋白的磷酸化至343％，上调AKT蛋白的磷酸化至319％，上调EGFR蛋白的磷酸化至170％; GSK-3β抑制剂LiCl、PI3K/AKT抑制剂LY294002、EGFR抑制剂AG1478和Src抑制剂PP2不同程度的影响胆管细胞癌细胞sulprostone上调的β-Catenin蛋白水平。
　　结论:
　　1.PGE2通过EP3-4和EP3-5受体亚型促进胆管细胞癌细胞的增殖，迁移和侵袭。
　　2.PGE2激活EP3-4受体，通过Src/EGFR/PI3K/AKT/GSK-3β信号转导通路抑制β-Catenin蛋白的降解，上调β-Catenin蛋白水平，进而上调c-Myc、Snail等蛋白的表达。

目录

声明

摘要

前言

一、材料与方法

1．实验材料

2 实验方法

二、结果

1．EP3受体亚型稳定高表达细胞株的筛选与鉴定

2 EP3受体亚型对胆管细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响

3．EP3-4受体通路在PGE2上调胆管细胞癌β-Catenin蛋白中的作用

4 EP3-4受体激动上调胆管细胞癌中β-Catenin下游c-Myc和Snail的mRNA转录和蛋白表达水平

5 EP3-4受体介导CCLP1细胞β-Catenin蛋白上调的机制

6 PI3K／AKT和GSK-3β在EP3-4受体激动上调β-Catenin蛋白水平中的作用

7 Gαs和Gαi蛋白在EP3-4受体信号上调β-Catenin蛋白水平中的作用

8 Src和EGFR在EP3-4受体激活上调β-Catenin蛋白水平中的作用

三、讨论

四、结论

参考文献

文献综述 β-Catenin蛋白与肿瘤关系的研究进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢