重组铜绿假单胞菌外毒素Exotoxin A及Ⅲ型分泌系统PcrV基因核酸疫苗的构建及免疫保护作用的研究

摘要

目的:构建编码铜绿假单胞菌外毒素A蛋白基因和Ⅲ型分泌系统PcrV蛋白基因的重组核酸疫苗，并转染真核细胞鉴定目的抗原蛋白的表达;免疫Balb/c小鼠并检测核酸疫苗诱导的免疫效应;构建免疫小鼠的铜绿假单胞菌急性肺炎模型，检测核酸疫苗对小鼠的保护作用。检测免疫佐剂CpG ODN1826的免疫增强效应。 方法:PCR法从铜绿假单胞菌基因组基因中扩增出编码外毒素A蛋白的基因toxA和编码PcrV蛋白的pcrV基因，并利用点突变法将toxA基因进行减毒改造，然后将toxAm基因片段和pcrV基因分别插入pIRES真核表达质粒的两个多克隆位点，构建重组核酸疫苗pIRES-toxAm、 pIRES-pcrV和pIRES-toxAm-pcrV。利用脂质体lipofectamine2000将重组核酸疫苗瞬时转染入HEK-293细胞，通过westernblotting检测重组外毒素A及PcrV蛋白在真核细胞中的表达。选取小鼠高亲和性的CpG ODN1826作为免疫佐剂，设定核酸疫苗组、核酸疫苗联合免疫佐剂组、空白对照组，肌肉注射接种Balb/c小鼠;免疫共3次后，收集小鼠血清，ELISA法检测抗原特异性抗体水平;收集小鼠脾细胞，检测抗原刺激下脾细胞增殖水平及脾细胞上清分泌细胞因子（Th1型:IFN-γ，IL-12;Th2型:IL-4，IL-10）水平。疫苗免疫小鼠1周后，用铜绿假单胞菌株PAO1经气道接种攻击小鼠，构建小鼠的急性铜绿假单胞菌肺炎模型，攻击3天后，分离小鼠肺组织，分别进行肺匀浆细胞菌落计数和肺组织HE染色，显微镜下进行肺组织病理学观察以及利用Image Plus6.0软件进行病理损伤半定量分析。 结果:构建的重组核酸疫苗pIRES-toxAm、 pIRES-pcrV和pIRES-toxAm-pcrV，经酶切及测序鉴定，与目的蛋白基因片段大小及序列相一致;转染HEK-293细胞后，可检测到真核细胞内目的蛋白外毒素A和PcrV的表达。免疫小鼠后，可在小鼠血清内检测到外毒素A和PcrV特异性抗体的表达;经抗原外毒素A和PcrV体外刺激后，免疫小鼠的脾细胞增殖水平显著高于对照组，并可生成高水平的Th1型和Th2型细胞因子，其中以pIRES-toxAm-pcrV刺激的免疫反应水平最高。此外，疫苗联合佐剂CpG ODN1826组的抗体水平、脾细胞增殖水平和细胞因子分泌水平与对应的疫苗组和对照组相比较，均有所增高。在小鼠急性PA肺炎模型中，疫苗组的肺部细菌负荷明显降低、肺组织病理损伤显著减轻，以pIRES-toxAm-pcrV组最为显著;同时，CpG ODN1826的联合免疫有效增强疫苗对小鼠肺组织的免疫保护效应。 结论:成功构建编码PA的减毒外毒素A和PcrV蛋白基因的重组核酸疫苗并在转染的真核细胞中得以有效的表达;重组核酸疫苗能够有效诱导Balb/c小鼠的体液免疫和细胞免疫反应;重组核酸疫苗主动免疫可减轻急性PA肺炎小鼠的病理损害，发挥有效的免疫保护作用。CpG ODN1826能够增强重组核酸疫苗的免疫效应和保护效应，是一种有效的免疫佐剂。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

Ⅰ 重组铜绿假单胞菌外毒素Exotoxin A及Ⅲ型分泌系统PcrV基因核酸疫苗的构建及真核表达的鉴定

材料与方法

结果

讨论

Ⅱ 重组铜绿假单胞茵外毒素Exotoxin A及Ⅲ型分泌系统PcrV基因核酸疫苗对Balb／c小鼠的免疫应答及保护效应

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

文献综述

攻读学位期间发表文章情况

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