子痫前期中非编码RNA对滋养细胞功能的调控及机制探索

摘要

子痫前期(Preeclampsia，PE)为妊娠期高血压疾病的一种，以妊娠20周后出现高血压、蛋白尿等为主要临床表现的妊娠特发疾病，甚至可致全身多脏器损伤，严重影响母婴健康，是孕产妇和围产儿病死率升高的重要原因。该病发病率居高不下，至今发病机制不明，病因学说众多，主要有子宫螺旋小动脉重铸不足（俗称“胎盘浅着床”）、炎症免疫过度激活、血管内皮细胞受损（包括炎症介质、氧化应激等）、遗传因素及营养缺乏、胰岛素抵抗等。其中子宫螺旋小动脉重铸障碍与血管内皮细胞受损在一定程度上与妊娠期绒毛外滋养细胞(ExtravillousTrophoblast，EVT)行为改变密切相关。继续深入探索影响EVT生物学功能的多方面因素并阐明其相关调节机理，进一步解读PE发病机制将为PE防治提供新的靶标。近年来大量研究报道非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）通过多种调控机制影响细胞功能，进而影响疾病的发生、发展，甚至有科学家预言在生物发育的过程中，ncRNA起着不亚于蛋白质的重要作用。故而本研究分别探讨了ncRNAs家族中的两个重要成员----微小RNA（microRNA，miRNA）和长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在子痫前期发病中对滋养细胞功能的调控，并分别从氧化应激与螺旋动脉重铸两个方面初步探索其相关机制:1.PE胎盘组织中表达异常的miR-101靶向调控内质网蛋白44(EndoplasmicReticulum Protein44，ERp44)，进而调节氧化应激诱导的滋养细胞过度凋亡反应，参与PE发病;2.PE胎盘组织中差异表达的lncRNA MVIH通过诱导JunB蛋白表达调节滋养细胞增殖、迁移、侵袭能力及滋养细胞和血管内皮细胞管型形成能力参与PE螺旋动脉重铸过程。本研究分为两个部分：
　　第一部分：MiR-101通过调控内质网蛋白44调节子痫前期内质网应激诱导的滋养细胞凋亡。
　　目的：⑴比较人类PE与正常胎盘组织中miR-101表达水平差异，结合课题组前期工作基础，分析miR-101与ERp44表达量之间的相关性及二者之间是否存在靶向结合。⑵探讨miR-101与ERp44结合是否对内质网应激及其诱导的滋养细胞凋亡起重要调节作用。
　　方法：①选择2011年12月至2012年3月在我南京医科大学第一附属医院行剖宫产分娩的60例产妇的胎盘绒毛组织，其中正常对照组和PE组各30例。采用实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR)检测30例PE及30例正常产妇胎盘组织中miR-101的表达水平，结合课题组前期检测此批30例胎盘组织中ERp44蛋白表达量，计算Person相关系数以分析miR-101与ERp44蛋白表达水平之间的相关性，并采用荧光素酶报告基因试验验证二者靶向结合关系。②为进一步验证二者靶向关系，在人类EVT HTR-8/SVneo中分别过表达和敲低miR-101表达后，首先采用qPCR验证过表达、敲低效率，之后采用蛋白质免疫印迹(Western blotting)法检测ERp44蛋白的表达改变。③为分析miR-101对胎盘功能细胞——EVT的生物学行为（凋亡）的影响，在HTR-8/SVneo细胞中分别过表达和封闭miR-101后，借助流式细胞技术及Hoechst染色法分析滋养细胞的凋亡数量改变，及Western blotting法检测凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2的表达情况。④在HTR-8/SVneo细胞中分别过表达和封闭miR-101表达后，用Western blotting法评估内质网应激相关信号通路激活情况，即检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)、活化转录因子6(ATF-6)、蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、磷酸化内质网核信号转导蛋白1(IRE1p)、活化转录因子4(ATF-4)等蛋白表达水平。⑤为进一步验证敲低miR-101后对内质网应激激活程度，同时给予内质网应激抑制剂4-PBA(4-Phenylbutyric acid，4-苯基丁酸)处理细胞后，Western blotting法再次检测上述蛋白表达情况。
　　结果：⑴纳入研究的30例PE及30例正常产妇一般临床资料比较:两组产妇的年龄、孕周、是否吸烟等指标均无显著性差异(p＞0.05)，收缩压、舒张压、蛋白尿及胎儿出生体重均具有统计学差异(p＜0.05或0.01)。⑵PE胎盘组织中miR-101表达下调，低于正常妊娠组60％(P＜0.05); Person相关性分析表明miR-101与ERp44蛋白表达量之间呈显著负相关（Pearson相关系数=-0.826，P＜0.01）;荧光素酶报告基因试验证实miR-101可以结合到野生型ERp44的3'UTR区，荧光抑制率达30％(p＜0.01)，二者存在一定的靶向结合关系。⑶HTR-8/SVneo中过表达miR-101后，miR-101表达水平较对照组升高28倍，干扰序列致miR-101表达下调45％，证明转染成功;过表达miR-101后ERp44表达下调约50％(P＜0.01);封闭miR-101表达后，ERp44表达升高2.39倍(P＜0.01)，差异有统计学意义。⑷HTR-8/SVneo中过表达miR-101后滋养细胞凋亡数量减少，凋亡执行蛋白Caspase-3、抑凋亡蛋白Bcl-2表达亦受到相应调节;封闭miR-101表达后凋亡反应加剧，与过表达效果相反。⑸HTR-8/SVneo中过表达miR-101后内质网应激信号通路被抑制，Caspase-12、ATF-6、PERK、CHOP、IRE1p、ATF-4等蛋白表达量显著增加;封闭miR-101表达后内质网应激信号通路被激活，Caspase-12、ATF-6、PERK、CHOP、IRE1 p、ATF-4等蛋白表达量明显减少。⑹封闭miR-101表达能部分逆转4-PBA对内质网应激信号通路的抑制作用。
　　结论：PE中miR-101通过靶向调节ERp44参与内质网应激诱导的滋养细胞凋亡过程。
　　第二部分：长链非编码RNA MVIH诱导JunB蛋白表达调节滋养细胞增殖、迁移、侵袭及内皮细胞管型形成能力参与子痫前期螺旋动脉重铸过程。
　　目的：①比较分析人类PE与正常胎盘组织中lncRNA MVIH表达水平差异，探讨其与PE发病是否相关。②探讨MVIH对滋养细胞及血管内皮细胞功能（增殖、迁移和侵袭、管型形成）的调控，分析其是否能够发挥对PE螺旋动脉重铸过程的调控。③分析MVIH调节上述过程的可能机制。
　　方法：⑴选择2011年12月至2012年3月在南京医科大学第一附属医院行剖宫产分娩的60例产妇的胎盘绒毛组织，其中正常对照组和PE组各30例。采用实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测30例PE及30例正常产妇胎盘组织中MVIH的表达水平。⑵为分析MVIH对胎盘功能细胞—滋养细胞的生物学行为的影响，在两滋养细胞系HTR-8/SVneo及JEG-3细胞中分别过表达和封闭MVIH后，首先qPCR实验检测过表达及封闭效率。⑶HTR-8/SVneo及JEG-3细胞中分别过表达和封闭MVIH后，采用MTT法检测滋养细胞的活力，及流式细胞仪分析各细胞周期所占比例的改变以探讨其对细胞增值潜力的调控。⑷为检测MVIH对滋养细胞迁移、侵袭功能的影响，采用Transwell（不铺胶）实验在HTR-8/SVneo细胞中分别过表达和封闭MVIH，另采用Transwell（铺胶）实验在JEG-3细胞中分别过表达和封闭MVIH后，探讨滋养细胞迁移、侵袭能力受MVIH调节情况。⑸在HTR-8/SVneo及脐静脉内皮细胞(HUVEC)两细胞株中分别过表达和封闭MVIH后，用管型形成试剂盒评估其对两细胞株管型形成能力的调节作用，并采用qPCR法分析两组细胞中干预MVIH表达后血管形成相关因子—血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(sFlt-1)、血管生成素Ⅰ和Ⅱ(AngⅠ，AngⅡ)的表达改变情况，进一步证实MVIH对滋养细胞及内皮细胞血管形成的影响。⑹为探索MVIH对滋养细胞及内皮细胞功能调控的潜在机制，在HTR-8/SVneo细胞中分别过表达和封闭MVIH后，采用蛋白质谱(iTRAQ)检测并分析、筛选受MVIH调控蛋白的表达情况。⑺对筛选目的蛋白进行过表达干预，观察HTR-8/SVneo细胞增殖、迁移功能改变情况，及HUVEC细胞管型形成能力功能改变情况;与si-MVIH协同处理细胞，进行补救实验，进一步验证目的蛋白直接受MVIH调节从而影响细胞上述功能。
　　结果：①纳入研究的30例PE及30例正常产妇一般临床资料比较:两组产妇的年龄、孕周、是否吸烟等指标均无显著性差异(p＞0.05)，收缩压、舒张压、蛋白尿及胎儿出生体重均具有统计学差异（p＜0.05或0.01）。②与正常妊娠组相比，PE胎盘组织中MVIH表达下调超过70％(P＜0.01)，表达差异显著。③HTR-8/SVneo中转染MVIH过表达质粒(pIRES2-MVIH)后，MVIH表达水平较对照组升高39.31倍，干扰序列封闭MVIH表达达72％; JEG-3细胞中过表达MVIH后，MVIH表达水平较对照组升高21.05倍，封闭MVIH后其表达下降达63％，证明转染成功。④HTR-8/SVneo及JEG-3细胞中过表达MVIH后两细胞活力提高，细胞有丝分裂周期加快，促进细胞由G1期向S期或G2期进展;封闭MVIH表达后两细胞活力下降，G1期细胞数量增加，S期或G2期细胞比例减少，细胞有丝分裂进程均受到不同程度抑制。⑤HTR-8/SVneo细胞中过表达MVIH后，穿膜细胞数量增加，迁移能力提高，干扰MVIH表达后结果相反;而在JEG-3细胞中过表达MVIH后，侵袭细胞数量增加，细胞侵袭能力提高，封闭MVIH表达后结果相反。⑥血管形成实验表明，HTR-8/SVneo及HUVEC细胞中过表达MVIH后，细胞形成管型分支节点数与分支长度均增加;同时，qPCR结果证实，两细胞中过表达MIVH组血管形成相关因子VEGF、AngⅠ、AngⅡ表达均上调，抑制血管生成因子sFlt-1表达下调;而干扰MVIH表达后结果相反。⑦蛋白质谱实验结果经过筛选后发现，JunB蛋白在过表达MVIH组比对照组表达上调，同时其在封闭MVIH组表达下调，由此证明JunB蛋白表达直接受MVIH调节。⑧HTR-8/SVneo细胞中过表达JunB后，相对于对照组，细胞增殖、迁移能力均提高;而在与si-MVIH共转染细胞后，上述促进作用部分被抑制。⑨HUVEC细胞中过表达JunB后，相对于对照组，管型形成能力增强;而在与si-MVIH共转染细胞后，上述促进作用部分被抑制。说明MVIH通过诱导JunB表达促进滋养细胞增殖、迁移能力及血管内皮细胞管型形成能力，从而发挥对螺旋动脉重铸过程的调节作用。
　　结论：PE中MVIH通过诱导JunB蛋白发挥对滋养细胞增殖、迁移、侵袭及血管形成能力的调节作用，从而参与PE螺旋动脉重铸过程。

目录

声明

英文缩写表

摘要

前言

参考文献

第一部分 MiR-101通过调控内质网蛋白44调节子痫前期内质网应激诱导的滋养细胞凋亡

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 长链非编码RNA MVIH通过诱导JunB蛋白促进滋养细胞增殖、迁移、侵袭及内皮细胞管型形成功能参与子痫前期螺旋动脉重铸过程

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文总结

综述一 子痫前期发病机制相关研究进展

综述二 子痫前期发病中长链非编码RNA与氧化应激的关系综述

学习期间论文发表情况

致谢