一种基于磁性纳米颗粒和化学发光适用于自动化的高灵敏病毒检测技术研究

摘要

本文分为以下几个部分进行探讨：
　　1.基于磁性纳米颗粒的细胞、细菌和病毒核酸提取方法研究
　　核酸提取是进行分子生物学研究和DNA传感器开发的关键步骤，核酸提取中残留的盐和其它有机污染物给DNA生物传感器的开发及病原体检测灵敏度等方面提出了挑战。磁性纳米颗粒(Magnetic Nanoparticles，MNPs)是生物医学中研究最多、应用最广的纳米材料，有许多特殊性质，在代替现有的病原体检测、肿瘤标志物检测、疾病的体外诊断等方面出现了很多应用研究。本论文建立了一种基于磁分离的核酸提取技术，从血清、细胞和细菌中提取高质量的核酸，充分利用磁分离的优势实现自动化操作。
　　实验过程中，对盐酸胍浓度和pH、乙醇量、洗涤液和洗脱液用量，并用PCR和电泳对提取的核酸进行了验证。另外，用此方法提取病毒血清时，我们还优化了裂解液的盐浓度和pH。结果表明，当裂解液中GuHCI浓度达到6 mol/L时，核酸产量最高，同时裂解液的pH为4时提取效果最佳。本研究建立了一种操作简单的方法，能够快速地从细胞，细菌和血清中同时提取DNA和RNA。PCR和RT-PCR结果也验证了此方法的可靠性。使用纳米颗粒可以促进使用这种方法在自动化核酸提取仪的开发和应用，为未来高通量半自动或全自动诊断系统的开发奠定基础。
　　2.基于多重PCR扩增和化学发光乙肝和丙肝病毒的高灵敏度检测
　　乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)是全世界威胁人类健康的最主要的疾病之一，感染了这两种病毒会导致慢性肝炎，肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC)的发生。因此对这一感染的早期诊断对疾病的治疗以及抑制疾病传播至关重要。目前的分子检测系统不但价格昂贵，而且检测灵敏度较低。因此，研发一种高灵敏且成本低廉的肝炎病毒诊断方法及早检测和治疗肝炎病毒，在全世界范围尤其是发展中国家有着非常迫切的需求。本研究提出了一种通过结合磁分离、一步法逆转录多重PCR和化学发光技术的高灵敏、可自动化检测临床样品乙肝和丙肝病毒的方法。对可能影响PCR扩增和化学发光的因素，如引物退火温度，探针与目的序列杂交温度，杂交时间和探针浓度等进行了探索。多重PCR的退火温度被确定为58℃，HBV探针杂交的最佳温度为45℃，HCV探针杂交的最佳在温度为55℃，最适探针浓度为5μM。当杂交在30 min时记录得到最大的化学发光信号。该方法成功地检测到10拷贝/mL HBV和HCV病毒，有很高的特异性和灵敏度，可满足临床病毒检测需要。
　　3.基于环介导等温扩增、化学发光的病毒检测方法初探
　　目前临床上用于病毒检测的方法有很多，如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(real-time qPCR)、酶联免疫吸附(ELISA)以及化学发光(CL)检测等。在这些检测技术中，基于核酸杂交的化学发光检测技术已经被广泛应用于检测乙肝、丙肝和艾滋病毒的临床检测。然而传统化学发光检测不仅需要通过聚合酶链反应(PCR)来得到有效的目标DNA，以便用于杂交，也需要长时间复杂的热循环过程和昂贵的实验仪器，这些方面的不足使得这一方法并不适合于医疗条件相对较低的社区医院或现场检测等情况。
　　环介导等温扩增技术（LAMP）能够让核酸在等温的条件下快速且高特异性地进行核酸扩增，避免了PCR长时间复杂的热循环过程和昂贵的实验仪器。本论文探索了一种基于逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)和化学发光相结合的办法检测RNA病毒。在LAMP扩增中加入biotin-11-dUTP使扩增产物带上生物素标记，再经过与特异性探针杂交，最后利用ALP-AMPPD化学发光反应体系判断样本中是否含有病毒核酸，以达到病原体检测目的。本论文优化了LAMP扩增和探针杂交的相关条件，如LAMP反应温度、杂交时间、杂交温度、探针浓度等。确定了反应温度为63℃时对HA和NA基因的扩增效率最佳;探针浓度为10μM，杂交时间为50 min时对于HA和NA探针杂交效果最佳;然而，两种基因探针的最适杂交温度略有不同，HA基因最佳杂交温度为50℃，NA探针最佳杂交温度为55℃。最后，通过灵敏度检测实验，我们得到本方法可以检测出103拷贝/mL的H7N9-RNA。本方法相比于传统的基于PCR的化学发光检测，检测时间缩短了近1h。此方法因基于LAMP扩增和核酸杂交，故在核酸检测方面具有高度特异性。此方法简化了检测过程，更容易实现自动化，因此在临床上有着广泛的应用前景。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 肝炎病毒概况

1．1．1 乙型肝炎病毒(HBV)

1．1．2 丙型肝炎病毒(HCV)

1．2 核酸提取方法

1．2．1 液相核酸提取法

1．2．2 固相核酸提取法

1．3 病毒核酸检测方法

1．3．1 免疫学检测

1．3．2 核酸检测技术

1．4 本论文研究内容及意义

参考文献

第二章 基于磁性纳米颗粒的DNA和RNA同时提取方法的建立

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 材料

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要仪器及设备

2．3 实验方法

2．3．1 细胞和细菌培养

2．3．2 核酸提取试剂配制

2．3．3 核酸提取

2．3．4 不同因素对核酸提取的影响

2．3．5 核酸浓度与纯度检测

2．3．6 RNA反转录

2．3．7 聚合酶链式反应

2．4 结果与讨论

2．4．1 基于磁分离的细菌核酸提取

2．4．2 基于磁分离的细胞核酸提取

2．4．3 病毒血清的核酸提取

2．5 本章小结

参考文献

第三章 基于磁性纳米颗粒、多重PCR及化学发光技术的病毒检测方法的建立

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 主要实验材料

3．2．2 实验所用核酸序列

3．2．3 主要仪器及设备

3．2．4 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 多重PCR条件优化及验证

3．3．2 HBV杂交条件优化

3．3．3 HCV杂交条件优化

3．3．4 HBV／HCV单重PCR扩增特异性及灵敏度探究

3．3．5 HBV／HCV多重PCR扩增特异性及灵敏度探究

3．4 本章小节

参考文献

第四章 基于环介导等温扩增及化学发光技术禽流感病毒(H7N9)检测方法研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料与仪器

4．2．2 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 RT-LAMP扩增温度优化

4．3．2 HA和NA基因化学发光检测

4．3．3 探针浓度对化学发光的影响

4．3．4 杂交温度对化学发光的影响

4．3．5 杂交时间对化学发光的影响

4．3．6 灵敏度检验

4．4 本章小结

参考文献

第五章 总结与展望

5．1 总结

5．2 展望

硕士期间发表的论文

致谢