HBV变异、宿主HLA基因多态及其交互作用与肝细胞癌发病风险的关联研究

摘要

肝细胞癌是世界范围内癌症死亡的第二大原因，其发病率在发达国家和发展中国家均呈上升趋势。HCC的发生发展受多个复杂因素的影响，包括病毒感染、环境因素以及宿主遗传变异等。慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是HCC最主要的危险因素。根据HBV全基因组序列差异大于8％，可将HBV分为不同基因型，另根据HBV全基因组序列差异介于4％-8％之间，可将HBV分为不同亚型。HBV基因型/亚型存在明显的地理分布特征，且与临床疾病结局、预后及干扰素治疗反应等相关。在东亚，尽管HBV基因型B和C型为流行基因型，但各基因型频率在该区域仍有较大差异。大量研究发现HBV C型与HCC的发生紧密相关，然而在以往的研究中，由于研究样本量相对较小，HBV基因型的低检测率以及不同的研究设计，研究结果中HBV基因型对HBV感染结局的效应也大为不同。另外，HBV基本核心启动子，很大程度上受增强子Ⅱ调控，控制着前C区mRNA的转录，前C蛋白经处理后产生HBV e抗原(HBeAg)，提示病毒复制活跃，与HCC发病风险增加相关。纵向研究提示一些位于增强子Ⅱ/基本核心启动子/前C区（EnhⅡ/BCP/PC）的突变在HCC诊断前的数年即开始发生并在HCC的发生发展中逐渐累积，该区突变常伴有重要的生物学活性改变。宿主遗传因素在HCC的发生中同样扮演着重要角色。多个研究发现位于染色体6p21区域的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)Ⅱ类分子上可能存在HCC易感位点。我国HCC全基因组关联研究(genome-wide associationstudies，GWAS)起步较早，目前开展的三项HBV相关的HCC GWAS均来源于中国人群，其中二项GWAS一致发现HLA-DQ/DR遗传变异与HBV阳性的HCC(HBV-HCC)易感性相关。在这两项独立的GWAS中，第一项研究分析了1，538例HBV-HCC患者和1，465例慢性HBV感染者的GWAS芯片结果，最终发现了位于HLA-DQA1和HLA-DRB1之间的HCC易感位点rs9272105。另一项研究分析了1，161例HBV-HCC患者及1，353例对照的GWAS芯片结果，最终发现了位于HLA-DQ的HCC易感位点rs9275319。这些结果提示HLA-DQ/DR分子在HCC的发生发展中起到重要作用。HBV变异很可能在炎性微环境下受病毒-宿主免疫压力相互作用而产生。因此，我们开展了一项大型多中心病例对照研究来探讨HBV基因型、EnhⅡ/BCP/PC区域的突变、GWAS识别的HLA-DQ/DR单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphisms，SNPs)（rs9272105和rs9275319）及其交互作用与HCC发病风险的关联，进而评估了这些因素对于HBV-HCC发病风险的预测效应。
　　本研究采用大样本多中心的病例对照研究设计，包括来自于江苏省中部和南部地区的1，507例HBV-HCC患者和1，560例HBV持续感染者，病例对照在区域、年龄和性别上进行了频数匹配。HBV-HCC患者中，535例来自南京，522例来自南通，450例来自启东;HBV持续感染者中，510例来自张家港，500例来自泰兴，550例来自丹阳。应用基于HBV型别特异性引物的巢式多重PCR检测HBV基因型A-F和亚型B1、B2、C1、C2，并采用巢式PCR和测序检测HBV EnhⅡ/BCP/PC区域的突变。此外，应用TaqMan基因分型方法检测并分析了HLA SNPs rs9272105和rs9275319与HCC发病风险的关联。进而构建HCC发病风险预测模型，将HBV基因型、与HCC发病风险独立相关的HBV突变、HLA SNPs(rs9272105和rs9275319)、HCC相关的相乘交互作用及交互作用的主效应作为候选预测因子，并构建逐步回归模型;采用受试者工作特征曲线(receiver-operator characteristic，ROC)来评估所构建的预测模型在HCC发生风险预测中的应用价值。发现各地区间HBV基因型B型和BC型的分布差异较大，但三个地区病例中HBV C型所占比例均明显高于对照组(所有病例vs.对照:80.6％ vs.34.4％)。与感染HBV B-相关基因型（B型和BC型）的个体相比，感染HBV非-B基因型（C型和D型）的个体发生HCC的风险增加了7.18倍(调整OR=8.18，95％ CI=6.91-9.68)。此外，HBV EnhⅡ/BCP/PC区域的11个热点突变C1653T、 C1673T、T1674C/G、C1730G、A1752G、T1753C、A1762T、G1764A、G1899A、G1915A/C和C1969T与HCC发病风险的增加或降低显著相关。Logistic回归分析结果显示，rs9272105的A等位基因能够显著增加HBV持续感染者发生HCC的风险（调整OR=1.31，95％CI=1.18-1.45）;而rs9275319的G等位基因能够显著降低HBV持续感染者发生HCC的风险(调整OR=0.66，95％CI=0.56-0.78)。通过交互作用分析，我们发现rs9272105与HBV基因型之间存在显著的相乘交互作用。进一步的叉生分析提示，相对于携带rs9272105GG基因型的HBV B-相关基因型感染者，携带AA基因型的HBV非-B基因型感染者发生HCC的风险增加了16.70倍（调整OR=17.70，95％CI=12.21-25.64）。我们还发现rs9272105与HBV突变C1673T、G1719T、A1726C、C1730G、A1752G和G1799C之间也存在显著的相乘交互作用。然而，我们并没有发现rs9275319与HBV基因型或突变间存在显著的相乘交互作用。通过逐步回归分析，HBV基因型、上述11个与HCC发病风险独立相关的HBV突变、HLA SNPs（rs9272105和rs9275319）以及rs9272105与A1752G的交互作用最终进入了HCC风险预测模型。包含HLA-DQ/DR SNPs、HBV基因型和突变的HCC风险预测模型，其曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.840，灵敏度为81.3％，特异度为74.8％。在这次多中心大样本的研究中，我们发现HBV基因型C型和亚型C2型是HCC的危险因素，且11个HBV突变与HCC的发病风险显著相关。另外，还发现HLA-DQ/DR rs9272105与HBV基因型和突变在HCC的发生中均存在显著交互作用，提示rs9272105可能具有潜在的生物学意义。更有意义的是，包含HLA-DQ/DR SNPs、HBV基因型和突变的HCC风险预测模型在鉴别HCC患者和对照上具有较高的灵敏度和特异度。因此，HBV基因型、突变和HLA-DQ/DRSNPs可作为监测HBV持续感染者的生物标志物，但这一结论还需大规模的前瞻性研究来进一步评估和验证。

目录

声明

摘要

前言

1．肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的流行现状

2．HBV结构及生物学特性

3．HBV变异及其在HCC发生发展中的生物学意义

4．HBV阳性的HCC(HBV-HCC)的遗传易感性区域

5．HBV感染与宿主多态在HCC发生中的交互作用研究进展

材料与方法

1．研究对象

2．流行病学调查

3．实验方法

4．统计分析方法

结果

1．研究对象的一般情况

2．HBV基因型、亚型在病例组与对照组中的分布

3．HBV突变与HBV-HCC发病风险的关联

4．HLA区域的两个位点与HBV-HCC发病风险的关联及其与HBV基因型、突变的交互作用分析

5．HLA SNPs、HBV基因型及突变在HBV-HCC预测中的应用价值

分析与讨论

总结

参考文献

综述 乙型肝炎病毒变异与肝细胞癌相关性的研究进展

附录

发表论文

致谢