大黄酸代谢活化产物与甲氨蝶呤在hOAT3上的摄取转运和相互作用研究

摘要

目的:大黄酸是双醋瑞因的主要活性成分。临床上常使用双醋瑞因联合甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)治疗类风湿性关节炎（RheμMatoid arthritis，RA）。而两药联合使用的药动学相互作用研究尚未见报道。本研究拟采用人肝微粒体、稳转细胞系和动物体内实验，初步探讨大黄酸及其活性代谢产物大黄酸乙酰葡糖醛酸(Rhein acyl glucuronide3，RAG)和甲氨蝶呤是否存在OAT上摄取转运的药动学相互作用，为临床安全、有效地用药提供一定的参考。
　　方法:
　　1.采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法，建立大黄酸和RAG药物浓度检测方法。
　　2.用人胚胎肾细胞293(HEK293)的空载体模式细胞（Mock细胞）和摄取转运体hOAT3过表达的稳转细胞系研究RAG和甲氨蝶呤的摄取转运特征。
　　3.用上述稳转细胞系考察RAG对hOAT3的抑制能力及在hOAT3介导下对甲氨蝶呤的抑制作用。用雄性Sprague Dawley(SD)大鼠探究大黄酸及RAG与甲氨蝶呤在动物体内联合给药时在OAT上的药物-药物相互作用。
　　结果:
　　1.RAG在PBS、甲醇中都不稳定，以含3％甲酸的甲醇处理后，RAG在样品溶液中稳定性良好。大黄酸和RAG的线性范围分别为100-25000nM和10-5000nM，日内和日间RSD均＜10.7％，准确度在95.8％-112％之间。最适宜孵育时间优化为40 min。
　　2.RAG在hOAT3细胞中的摄取与在相应转染空载体细胞中的摄取没有显著性差异，在四个不同浓度时hOAT3的胞内积累量分别是空载体的1.2、1.5、2.2和2.0倍。相反，甲氨蝶呤在hOAT3细胞中的摄取与在相应转染空载体细胞中的摄取倍数差异较大，不同浓度时hOAT3的胞内积累量分别是空载体的5.0、5.3、16.0和10.1倍。
　　3.RAG对经hOAT3特征性底物3-硫酸雌酮钠盐(E-3-S)摄取的抑制率接近100％，该抑制率与已知hOAT3的强效抑制剂丙磺舒的抑制率(97.9％)相似，并且RAG的IC50值仅为66.73 nM。浓度为1μM的RAG可显著抑制细胞对于甲氨蝶呤的摄取，抑制率为98.14％。在RAG和甲氨蝶呤的体内药物相互作用研究中，联合使用RAG和甲氨蝶呤的大鼠血液中，甲氨蝶呤的血药浓度在30min、3h和12h三个时间点均有统计学差异(P＜0.05)，RAG和甲氨蝶呤联合用药组中甲氨蝶呤的AUC0-12（5068±637 ng/mL*h）和t1/2（8.54±7.73h）相较于单独用药组(分别为3402±583 ng/mL*h和6.35±7.78h)均表现出一定程度的提高。
　　结论:
　　1.本研究建立的测定肝微粒体体系中大黄酸及其活性代谢产物RAG的检测方法，具有灵敏、准确、快速的特点，能应用于大黄酸及RAG在肝微粒体酶中的代谢研究。
　　2.RAG不是hOAT3的底物，甲氨蝶呤是hOAT3的底物。RAG是hOAT3的强效抑制剂，在浓度为1μM时可显著抑制细胞对于甲氨蝶呤的摄取。
　　3.RAG可能会影响甲氨蝶呤在OAT水平上的转运，RAG与甲氨蝶呤合用可能导致临床药物-药物相互作用的产生。

目录

声明

摘要

缩略语表

前言

第一章 大黄酸及其代谢活化产物的相关研究进展

1．大黄及大黄酸

2．大黄酸代谢活化产物及其毒性

3．大黄酸及代谢活化产物的转运机制研究

4．药物-药物相互作用研究方法

5．药物与转运体相互作用的研究方法

6．肾脏有机阴离子转运体(OAT)

7．双醋瑞因与甲氨蝶呤

8．研究目的

第二章 肝微粒体孵育体系中大黄酸及其代谢活化产物的检测方法研究

1．引言

2．材料与方法

2．1 试剂与仪器

2．2 实验方法

3．结果

3．1 方法专属性

3．2 线性范围

3．3 精密度与准确度

3．4 温孵样品处理条件优化

3．5 温孵时间优化

3．6 大黄酸在人以及大鼠肝微粒体中的代谢

4．讨论

第三章 大黄酸乙酰葡糖醛酸和甲氨蝶呤由hOAT3介导的摄取转运机制研究

1．引言

2．材料与方法

2．1 试剂与仪器

2．2 色谱条件和质谱条件

2．3 实验方法

3．结果

3．1 转运体介导的RAG的摄取结果

3．2 转运体介导的甲氨蝶呤的摄取结果

4．讨论

5．结论

第四章 大黄酸及大黄酸乙酰葡糖醛酸与甲氨蝶呤的体内外药物-药物相互作用研究

1．引言

2．材料与方法

2．1 试剂与仪器

2．2 hOAT3介导的细胞抑制实验

2．3 动物及饲养

2．4 动物实验方法

2．5 样品处理

2．6 数据处理

3．结果

3．1 RAG对hOAT3介导的E-3-S摄取的抑制

3．2 RAG的IC50值

3．3 RAG对hOAT3介导的甲氨蝶呤摄取的抑制

3．4 大黄酸和甲氨蝶呤的体内药物相互作用

3．5 RAG和甲氨蝶呤的体内药物相互作用

4．讨论

5．结论

第五章 总结

参考文献