C末端缺失的GATA4通过增强AKT/FOXO的表达促进心肌细胞凋亡

摘要

目的:GATA4是参与心脏发育的重要转录因子。本课题组前期在室间隔缺损(ventricular septal defect，VSD)患者心肌组织中发现了一种特殊类型的GATA4突变(p.S335X)，此突变可使终止密码子提前产生，导致GATA4的C末端缺失。为进一步了解p.S335X突变对心肌细胞的作用及其机制，我们使用体外培养的大鼠心肌细胞株H9C2，转染野生型GATA4(pcDNA6-GATA4-WT，WT)及突变型GATA4 p.S335X(pcDNA6-GATA4-MU，MU)载体，验证转染效率后，考察GATA4 p.S335X对H9C2细胞凋亡的影响及经典凋亡通路AKT/FOXO/Bcl-2的参与作用。在此基础上，我们进一步筛选了除经典Bcl-2凋亡途径之外，GATA4p.S335X对其他凋亡相关的下游分子/信号通路的调控作用。
　　方法:大鼠心肌细胞H9C2体外培养，转染WT、MU及对照(pcDNA6，EV)载体，通过收集转染后H9C2细胞的RNA和总蛋白，分别使用Real-TimePCR和Western blot验证细胞中GATA4mRNA和蛋白表达，鉴定转染成功。进一步使用TUNEL法检测细胞凋亡;通过Real-Time PCR和Western blot分别测定经典凋亡通路AKT/FOXO/Bcl-2相关因子的mRNA表达、蛋白表达及关键酶的磷酸化水平;以PCR Array技术筛选新的凋亡信号通路。
　　结果:Real-Time PCR结果证实，WT和MU组GATA4 mRNA表达显著升高;Western blot结果显示:WT和MU组GATA4蛋白表达显著增多，且较之WT组，MU组GATA4蛋白分子量较低(WT组:50KDa，MU组:40KDa);上述结果提示GATA4 WT和MU转染成功。TUNEL结果表明，未加TNF时转染MU的H9C2细胞比转染WT的H9C2细胞内可见更明显的凋亡，加入TNF(100ng/ml)后，MU与EV组凋亡明显高于WT组，提示GATA4WT对凋亡具有一定抑制作用，该作用在GATA4MU条件下被反转。Western blot结果显示:MU组中调促进凋亡信号GSK3β，p-GSK3β，FOXO3、BAX表达上调，抑制凋亡信号AKT、p-AKT、Bcl-2表达降低;而Real-Time PCR结果显示上述因子的mRNA表达没有差异。PCRArray筛选出下列基因表达在MU组中升高:Tp53、Tp53bp2、Bcl-10、Casp3、Gadd45α、Jun、Mapk14、Mapk8、Pdgfra、Pdk2、Pdpk1、Tsc1，Casp7、Ltbr、Mapk8ip1、Tnfsf10、Pdk1、 Pik3r1。
　　结论: GATA4 p.S335X不具备野生型GATA4抑制细胞凋亡的功能;该现象可能与经典的AKT/FOXO/Bcl-2途径有关;此外，C末端缺失的GATA4p.S335X还可能作用于非典型凋亡途径，包括:p53/Tnfsf10、MAPK/Gadd45α、JNK/c-jun、PDK1/PKC/Bcl10/caspase7等。

目录

声明

摘要

前言

GATA4与凋亡

凋亡相关的信号因子

材料和方法

一、材料与试剂

二、实验方法

2．2 Real-Time PCR

2．3 细胞学实验

2．4 TUNEL

2．5 PCR Array

2．6 统计分析

结果

3 GATA4 p．S335X对AKT／FOXO／Bcl-2通路的影响

4 TNF诱导后GATA4 p．S335X对AKT／FOXO／Bcl-2通路的影响

5 PCR Array筛选GATA4 p．S335X与野生型差异基因

讨论

结论和展望

参考文献

中文综述 转录因子与心肌细胞凋亡的关系

攻读学位期间发表的文章情况

致谢