重组人腺病毒5型载体埃博拉疫苗临床研究及单克隆中和抗体筛选

摘要

目的:(1)本研究旨在评估中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所和天津康希诺生物技术有限公司联合研制的重组埃博拉病毒病疫苗(Ad5-EBOV)在中国18-60周岁健康人群中免疫接种的安全性、耐受性及免疫原性。(2)利用糖蛋白(Glycoprotein，GP)特异性探针筛选抗埃博拉病毒全人源单克隆抗体，对筛选得到的单抗与GP蛋白的结合活性进行验证，同时进行中和活性鉴定，为研发新型疫苗与药物提供技术支持。
　　方法:本研究分为两部分先后在江苏省泰州疫苗工程中心和江苏省疾病预防控制中心开展，首先进行单中心、剂量递增、随机双盲、安慰剂对照设计的Ⅰ期和Ⅰ期加强临床试验，随后采集加强试验后志愿者血样并进行筛选单克隆中和抗体。本试验将筛查合格的18-60周岁健康成人入组以1∶1∶1的比例分别接种低剂量或高剂量的Ad5-EBOV或安慰剂。在基础免疫后第6个月再次对志愿者接种同剂型加强针疫苗。安全性评价主要终点为接种疫苗后7天内征集性不良反应，免疫原性评价主要终点为接种后28天内埃博拉GP蛋白特异性抗体滴度和T细胞应答。接种加强针疫苗后第2周对志愿者抽取血样本，挑选GP蛋白特异性抗体滴度较高的8个志愿者样本进行分离外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)，通过流式细胞术筛选埃博拉病毒GP蛋白特异性记忆B细胞，用单细胞克隆技术对细胞扩增抗体基因并构建抗体载体，此后再进行验证抗体结合活性以及中和活性。
　　结果:(1)临床试验基础免疫阶段共入组了120名志愿者，其中低剂量和高剂量疫苗组、安慰剂对照组各40人。所有志愿者均完成0-28天的安全性访视及免疫原性观察，无失访和脱落。基础免疫后第6个月进行加强免疫时，10名志愿者因拒绝接种而脱落，剂量组间脱落率差异无统计学意义。基础免疫和加强免疫后0-7天观察期内，总体征集性不良反应均以轻度不良反应为主，剂量反应关系明显。低剂量和高剂量组的志愿者GP蛋白特异性抗体水平在基础免疫后第14天和28天均得到明显增加，抗体几何平均滴度(Geometric Mean Titre，GMT)水平有明显的剂量反应关系，剂量越高，GP抗体水平越高。(2)对8名志愿者血样以及1名对照血样进行了分离PBMC，细胞浓度在3.3×106-8×106个范围之间。其中4名细胞浓度较高的志愿者样本进行了流式细胞分选预实验，共分选出153个GP特异性B细胞。对B细胞采用单细胞克隆技术进行扩增抗体基因，目前共扩增出10个重链基因片段，尚无法进行配对抗体。
　　结论:本研究发现高剂量重组腺病毒5型载体埃博拉疫苗具有良好的安全性和免疫原性。志愿者接种一次高剂量疫苗后能够在第14天产生较高的糖蛋白特异性体液免疫和T细胞应答。低剂量埃博拉疫苗同样也是安全的，但其免疫原性易受到体内5型腺病毒预存免疫力的影响。间隔6个月进行5型腺病毒埃博拉疫苗初免-加强也可以诱导更强和更长时间的抗体应答。筛选出10个重链基因片段，无法确定接种Ad5-EBOV疫苗所诱导的抗体具有中和活性，仍需进行后续功能性验证实验并进一步优化试验方法筛选得到更多目的抗体。

目录

声明

摘要

主要缩略词表

第一章 前言

1．1 埃博拉病毒简介

1．2 抗病毒研究现状

第二章 重组埃博拉病毒病疫苗Ⅰ期临床试验及加强临床试验

2．1 材料与方法

2．1．1 研究总体设计

2．1．2 评价指标和分析

2．1．3 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 安全性分析

2．2．2 免疫原性分析

2．3 讨论

第三章 全人源埃博拉单克隆中和抗体筛选

3．1 材料与方法

3．1．1 用流式细胞术分选能与埃博拉病毒GP蛋白特异结合的记忆B细胞

3．1．2 用单细胞克隆技术制备全人源单克隆中和抗体，并通过体外试验评价其功能

3．2 实验方法

3．2．1 PBMC的制备

3．2．2 流式细胞术筛选

3．2．3 从单克隆B细胞扩增抗体基因并构建抗体表达载体

3．3 技术路线

3．4 结果

3．4．1 PBMC分离结果

3．4．2 流式细胞术筛选结果

3．5 讨论

第四章 总结与展望

参考文献

综述 埃博拉疫苗临床试验研究进展

作者简介

致谢