肽基精氨酸脱氨酶抑制剂对失血性休克相关急性肺损伤保护作用及机制研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分:失血性休克大鼠中性粒细胞Cit H3表达变化的实验研究
　　目的：探讨失血性休克(hemorrhagic shock,HS)时大鼠循环中中性粒细胞瓜氨酸化组蛋白3(citrullinize histone3，Cit H3)以及肺组织Cit H3表达变化。
　　方法：选用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，将大鼠分为两组，失血性休克(HS）组和假手术(Sham)组，HS组是将大鼠股动静脉穿刺、置管，10分钟放血总血容量40％，建立HS模型。休克模型建立6小时后两组动物分离循环中中性粒细胞，Western blot测定中性粒细胞CitH3和总的组蛋白3(Total H3)表达量，免疫组化方法检测肺组织Cit H3的表达。
　　结果：与假手术组(Sham)相比，HS组循环中性粒细胞的Cit H3蛋白表达量与Sham组比较有明显升高(P＜0.05)，但两组之间Total H3蛋白表达量无显著的统计学差异(P＞0.05)。免疫组化结果显示Cit H3主要定位于细胞核中，呈棕色表达，HS组肺组织CitH3的表达较Sham组显著升高。
　　结论：HS引起SD大鼠循环中性粒细胞及肺组织中CitH3表达增加。
　　第二部分:肽基精氨酸脱氨酶抑制剂YW3-56对失血性休克大鼠急性肺损伤及存活率影响的实验研究
　　目的：探讨一种新型肽基精氨酸脱氨酶(Peptidylarginine deiminases，PADs)抑制剂YW3-56在失血性休克急性肺损伤模型中的保护作用。
　　方法：选用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，分为三组，假手术(Sham)组，失血性休克(HS)组和YW3-56处理组。Sham组不给予特殊处理;HS组为大鼠股动静脉穿刺、置管，建立HS模型;YW3-56处理组在大鼠造失血性休克模型成功后给予YW3-56(10 mg/kg)腹腔注射处理。非致死性休克模型:10分钟放血量占全身血容量40％，大鼠饲养笼继续继续观察6小时后，处死，肺组织病理切片染色，ELISA法检测血浆细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子-1(cytokine-inducedneutrophil chemoattractant-1，CINC-1)的水平。化学比色法测定肺组织髓过氧化物酶(MPO)含量，Western blot检测肺组织细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)的表达。致死性休克模型:40分钟共放血血容量55％，开始10分钟放血量占全身血容量30％，剩余25％在30分钟内持续缓慢放血。大鼠饲养笼继续继续观察12小时，并对各组动物生存时间进行记录。
　　结果：与Sham组相比，HS模型组肺组织的CINC-1、ICAM-1含量和MPO活性显著升高，YW3-56处理显著降低HS模型组肺组织的CINC-1、ICAM-1含量和MPO活性;Sham组大鼠肺组织无明显炎症损伤表现;HS模型组中大鼠肺组织中可见明显细胞间质水肿，出血，中性粒细胞浸润，肺泡壁轻度增厚的炎症损伤改变;腹腔给予YW3-56(10 mg/kg)处理可显著减轻HS引起的肺组织炎症损伤程度(P＜0.05）。对两组进行致死性休克模型生存分析结果显示12小时内HS模型组生存率仅为20％，而YW3-56处理后HS模型组的生存率则有60％，明显高于单纯的HS模型组(P＜0.05)。
　　结论：新型PADs抑制剂YW3-56可显著降低HS大鼠肺组织CINC-1、ICAM-1的表达和MPO活性，进而抑制HS相关性急性肺损伤，并明显提高失血性休克大鼠12h存活率。
　　第三部分:YW3-56对中性粒细胞Cit H3表达及NETs形成影响
　　目的：探讨肽基精氨酸脱氨酶（Peptidylarginine deiminases，PADs）抑制剂YW3-56对中性粒细胞Cit H3表达及中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular networks，NETs)形成的影响。
　　方法：动物实验部分:选用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，分为二组，失血性休克(HS)组和YW3-56处理组，建立HS模型;YW3-56处理组在大鼠造失血性休克模型成功后给予YW3-56(10 mg/kg)腹腔注射预处理。分离循环中中性粒细胞，Western blot测定中性粒细胞CitH3和总的组蛋白3(Total H3)表达量，免疫荧光检测肺组织Cit H3、MPO表达。细胞实验部分:培养HL-60细胞，并诱导分化为中性粒细胞样细胞，分别给予钙离子载体(calciumionophore)、内毒素(LPS，200ng/ml)、缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation，H/R)诱导NETs形成以及阴性对照处理，并对各组给予YW3-56 (5μM)处理，Western blot检测细胞Cit H3、Total H3、Cit H4、Total H4表达量变化，细胞免疫荧光以及共聚焦显微镜观察NETs形成情况。
　　结果：Western blot结果提示HS模型组循环中中性粒细胞Cit H3表达增多，给予肽基精氨酸脱氨酶抑制剂干预后Cit H3表达显著下降。免疫荧光提示HS模型组肺组织Cit H3、MPO表达增多，NETs形成增加，给予肽基精氨酸脱氨酶抑制剂干预后Cit H3、MPO表达显著下降，NETs形成降低。HL-60细胞可被全反式维甲酸(ATRA，1μM)诱导成中性粒细胞样细胞，并经calcium ionophore(钙离子载体)、LPS、H/R处理后Cit H3、Cit H4表达增多，NETs形成增加，给予YW3-56(5.0 μM)处理后，Cit H3、Cit H4表达显著下降，NETs形成降低。
　　结论：新型PADs抑制剂YW3-56显著减弱HS大鼠肺组织及循环中Cit H3表达和NETs的形成。在细胞水平，YW3-56明显抑制组蛋白瓜氨酸化，抑制NETs形成，从而减轻炎症反应，可能是治疗失血性相关导致急性肺损伤的机制之一。
　　第四部分:NETs对巨噬细胞促炎因子、趋化因子分泌的影响
　　目的：探讨中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular networks，NETs)对巨噬细胞促炎因子、趋化因子分泌的影响。
　　方法：体外培养HL-60细胞株，全反式维甲酸(ATRA，1μM)诱导分化为中性粒细胞样细胞，后经calcium ionophore刺激诱导，并用或不用YW3-56预处理，刺激后提取得到相当于NETs混合物的液体，将NETs样混合物刺激巨噬细胞，ELISA法检测细胞培养上清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)和细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子-1 (cytokine-inducedneutrophil chemoattractant-1，CINC-1)的水平。
　　结果：NETs刺激巨噬细胞后，细胞培养上清的TNF-α、IL-6和CINC-1水平显著升高(P＜0.05），经YW3-56预处理得到的NETs混合液刺激巨噬细胞，TNF-α、IL-6和CINC-1水平明显低于相应的未经YW3-56预处理组。且给予Cit H3 Ab、Cit H4 Ab中和NETs中的成分，以及DNaseⅠ预处理，降解NETs，显著降低NETs诱导的炎症因子TNF-α、IL-6和CINC-1水平的升高。
　　结论：NETs能够促进巨噬细胞促炎因子TNF-α和IL-6的分泌以及趋化因子CINC-1的表达，YW3-56可以通过抑制NETs形成，从而减轻巨噬细胞细胞因子的分泌;且通过中和NETs的成分Cit H3、Cit H4，或降解NETs可减轻巨噬细胞细胞因子的分泌。NETs形成可能在失血性休克致急性肺损伤巨噬细胞激活中发挥重要作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

文献综述

第一部分：失血性休克大鼠中性粒细胞Cit H3表达变化的实验研究

第二部分：肽基精氨酸脱氨酶抑制剂YW3-56对失血性休克大鼠急性肺损伤及存活率影响的实验研究

第三部分：YW3-56对中性粒细胞Cit H3表达及NETs形成影响

第四部分：NETs对巨噬细胞促炎因子、趋化因子分泌的影响

全文总结

参考文献

作者简介

在读研究生期间已发表的论文如下

致谢