MiR-637通过靶向调控CTSB抑制胆管癌QBC939细胞增殖与活力

摘要

本文从以下几个部分展开论述： 第一部分 MiR-637通过靶向调控CTSB抑制胆管癌QBC939细胞增殖与活力 目的：MiR-637对肝细胞癌及脑胶质细胞瘤的抑制作用已有报道，miR-637被报道在胆管癌组织中低表达，miR-637对胆管癌的功能作用及机制研究鲜见报道。生物信息软件预测miR-637对CTSB有调控可能，前期质谱分析发现胆管癌组织CTSB较癌旁组织表达明显增高（8.4倍），CTSB被报道在人类多种恶性肿瘤的发生、发展及转移中起着重要的作用，在胆管癌组织及血液中均高表达，与胆管癌分期、预后呈负相关。本实验设想通过实验验证miR-637是否对胆管癌细胞增殖、迁移存在调控作用，是否通过功能的和直接的靶向调控CTSB发挥对胆管癌细胞活力的抑制作用。 方法：在实验中，我们使用qRT-PCR方法检测了miR-637在胆管癌细胞系与正常胆管上皮细胞的表达，检测人类胆管癌组织相对于癌旁组织的表达。选取表达明显下调的QBC939细胞进行功能实验研究。通过慢病毒感染miR-637至胆管癌细胞QBC939，并通过荧光率验证感染效率。分别用MTT、划痕实验、流式细胞分析、Westblot来检测细胞增殖活力、细胞迁移能力、细胞凋亡、周期以及对凋亡蛋白Caspase3与Caspase9表达的影响。通过生物信息软件预测CTSB为miR-637可能调控的备选靶基因。使用荧光素酶报告实验验证共转染miR-637mimics与野生型CTSB组荧光率是否较空白对照及mut组显著降低。RT-PCR和Western blot分别从基因与蛋白层面检测过表达miR-637对CTSB的表达的影响。RT-PCR法对41例胆管癌标本的miR-637及CTSB mRNA水平进行相关性分析，进一步验证miR-637是否存在与CTSB mRNA的负性相关性。 结果：胆管癌细胞系（QBC939、RBE、HuCCT1）的miR-637水平均显著高于胆管上皮细胞（HIBEpiC），而QBC939细胞表达水平高于其他几种胆管癌细胞，胆管癌组织miR-637表达较癌旁组织显著升高。预实验发现：RT-PCR法显示胆管癌细胞QBC939miR-637的表达丰度为低。慢病毒转染miR-637至QBC939细胞72小时显示转染后细胞形态正常，转染效率（荧光率）70-80%。MTT实验发现过表达miR-637组胆管癌细胞的增殖活力显著下降，划痕实验显示过表达miR-637抑制了胆管癌细胞的迁移，流式细胞分析显示过表达miR-637促进了胆管癌细胞的凋亡，阻滞了胆管癌细胞周期。Westblot发现过表达miR-637促进了Caspase3与Caspase9的表达。通过Targetscan数据库分析得知CTSB为miR-637备选靶基因，通过荧光素酶报告实验表明：共转染野生型miR-637mimic与CTSB组较mut组与空白对照组荧光率显著降低。RT-PCR及Westblot显示过表达miR-637组细胞CTSB mRNA与蛋白表达水平均显著降低。对41例胆管癌组织的miR-637与CTSB mRNA表达行相关性分析发现：miR-637水平与CTSB mRNA表达呈负相关。结论：miR-637可能通过结合CTSB5’UTR端调控CTSB的表达而抑制胆管癌细胞的增殖与活力。miR-637可能通过上调凋亡蛋白表达促进了胆管癌细胞的凋亡。综上所述，miR-637在胆管癌的病理演变中扮演重要的角色。 第二部分 shRNA干扰CTSB抑制胆管癌细胞QBC939的增殖及活力 目的：研究shRNA对CTSB干扰效果以及Cathepsin B(CTSB)在人类胆管癌(CCA)细胞QBC939增殖、迁移、凋亡及细胞周期的作用。 方法：通过构建和包装CTSB-shRNA慢病毒载体转染QBC939细胞，测定shRNA对CTSB的感染和干扰效率，检测shRNA干扰对QB939细胞CTSB增殖、迁移能力、凋亡以及细胞周期的影响。 结果：shRNA干扰QBC939细胞CTSB mRNA的表达较QBC939-NC细胞（空白质粒干扰细胞）显著降低。CTSB干扰导致QBC939细胞增殖及迁移能力显著降低。另外，CTSB干扰使细胞更多的停留于G0/1期，G2/M期的细胞受到阻滞。 结论：CTSB对CCA细胞增殖与迁移起到重要作用。shRNA显著抑制了CTSB的表达，从而显著降低了QBC939细胞的增殖、迁移与侵袭能力，使细胞更多的停留在G0/1期，并促进了QBC939细胞的凋亡。

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