长链非编码RNA NANCI-NKX2.1信号通路在BPD新生小鼠肺组织中作用的研究

摘要

目的： 采用腺病毒介导的lncRNA NANCI干扰及过表达技术研究NANCI-NKX2.1信号通路在新生小鼠支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia,BPD）发病机制中的作用。 方法： 本研究通过NANCI干扰及过表达两种方式探索NANCI-NKX2.1信号通路参与BPD发病机制： Ⅰ.采用腺病毒介导的NANCI干扰技术处理正常新生小鼠。将32只C57BL／6J（B6）新生小鼠随机分为4组：实验组、阴性对照组、生理盐水对照组和空白对照组，每组8只，实验组于生后第2天经鼻腔吸入含Ad-NANCI shRNA的生理盐水1ul，阴性对照组将含无关序列发卡结构病毒质粒Ad-GFP NC的生理盐水1ul吸入肺内，生理盐水对照组将生理盐水1ul吸入肺内，空白对照组除未予鼻腔吸入以外其他控制因素与上三组相同。出生7天后处死各组小鼠并采集肺组织（所有操作均符合实验动物管理条例，处死时尽量减少痛苦），冰冻空白切片察看小鼠肺组织荧光表达，苏木精-伊红(HE)染色察看小鼠肺组织病理变化，RT-qPCR检测NANCI表达水平，RT-qPCR及Western Blot技术分别检测NKX2.1、SPC、AQP5mRNA和蛋白表达水平。 Ⅱ.采用腺病毒介导的NANCI过表达技术干预高氧诱导的BPD新生小鼠。将32只B6新生小鼠随机分为4组：实验组、阴性对照组、生理盐水对照组和空白对照组，每组8只，四组小鼠均置于高氧环境下饲养（FiO2≥95%），实验组于生后第2天经鼻腔吸入含Ad-NANCI的生理盐水1ul，阴性对照组将含无关序列发卡结构病毒质粒Ad-GFP的生理盐水1ul吸入肺内，生理盐水对照组将生理盐水1ul吸入肺内，空白对照组除未予鼻腔吸入以外其他控制因素与上三组相同。出生7天后处死各组小鼠并采集肺组织（所有操作均符合实验动物管理条例，处死时尽量减少痛苦），冰冻空白切片察看小鼠肺组织荧光表达，苏木精-伊红(HE)染色察看小鼠肺组织病理变化，RT-qPCR检测NANCI表达水平，RT-qPCR及Western Blot技术分别检测NKX2.1、SPC、AQP5mRNA和蛋白表达水平。 结果： Ⅰ.采用腺病毒介导的NANCI干扰技术处理正常新生小鼠 1.肺组织免疫荧光：新生小鼠鼻内吸入腺病毒载体，一周后实验组及阴性对照组肺组织可见绿色荧光表达；生理盐水及空白对照组未见荧光表达。 2.肺组织病理：①阴性对照组、生理盐水对照组和空白对照组肺泡大小基本均一，形态尚规整，肺泡间隔较薄；而实验组肺组织新隔形成减少，肺泡腔扩大、部分融合，肺泡二次分隔抑制，肺泡数目较少，肺泡大小不等，肺泡结构紊乱，支气管壁增厚。②RAC值：四组间差异有显著性（F=7.26，P=0.001）；实验组RAC值下降，与其他三组相比均有统计学意义(均P＜0.05)；与阴性对照组相比，生理盐水及空白对照组RAC值无显著差别（P＞0.05，P＞0.05）。 3.肺组织NANCI表达：四组间NANCI相对表达量差异有显著性（F=37.96，P=0.000）；实验组NANCI相对表达量低于各对照组，为阴性对照组的0.26（P＜0.05）；与阴性对照组相比，生理盐水及空白对照组NANCI相对表达量均无显著差别（P＞0.05，P＞0.05）。 4.NKX2.1mRNA和蛋白表达：四组间NKX2.1mRNA相对表达量差异有显著性（F=20.38，P=0.000）；实验组低于各对照组，为阴性对照组的0.50（P＜0.05）；与阴性对照组相比，生理盐水及空白对照组NKX2.1mRNA相对表达量无显著差别（P＞0.05，P＞0.05）。实验组肺组织NKX2.1蛋白表达低于各对照组（均P＜0.05）。 5.SPC mRNA和蛋白表达：四组间SPC mRNA相对表达量差异有显著性（F=18.28，P=0.000）；实验组低于各对照组，为阴性对照组的0.46（P＜0.05）；与阴性对照组相比，生理盐水及空白对照组SPC mRNA相对表达量无显著差别（P＞0.05，P＞0.05）。实验组肺组织SPC蛋白表达低于各对照组（均P＜0.05）。 6.AQP5mRNA和蛋白表达：四组间AQP5mRNA相对表达量差异有显著性（F=21.84，P=0.000）；实验组低于各对照组，为阴性对照组的0.48（P＜0.05）；与阴性对照组相比，生理盐水及空白对照组AQP5mRNA相对表达量无显著差别（P＞0.05，P＞0.05）。实验组肺组织AQP5蛋白表达低于各对照组（均P＜0.05）。 Ⅱ.采用腺病毒介导的NANCI过表达技术干预高氧诱导的BPD新生小鼠 1.肺组织免疫荧光：新生小鼠鼻内吸入腺病毒载体，一周后实验组及阴性对照组肺组织可见绿色荧光表达；生理盐水及空白对照组未见荧光表达。 2.肺组织病理：①实验组肺组织肺泡大小基本均一，形态尚规整，间隔变薄，肺泡腔内可见较多冠状突起，为新生肺泡隔延伸，肺泡平均截距减小，肺泡计数增多，纤维化程度减轻；阴性对照组、生理盐水对照组和空白对照组新隔形成减少，肺泡腔扩大、部分融合，肺泡数目较少。②RAC值：四组间差异有显著性（F=8.40，P=0.000）；实验组RAC值增高，实验组RAC与其他三组相比均有统计学意义(均P＜0.05)；与阴性对照组相比，生理盐水及空白对照组RAC值无显著差别（P＞0.05，P＞0.05）。 3.肺组织NANCI表达：四组间NANCI相对表达量差异有显著性（F=57.18，P=0.000）；实验组NANCI相对表达量高于各对照组，为阴性对照组的2.70（P＜0.05）；与阴性对照组相比，生理盐水及空白对照组NANCI相对表达量无显著差别（P＞0.05，P＞0.05）。 4.NKX2.1mRNA和蛋白表达：四组间NKX2.1mRNA相对表达量差异有显著性（F=28.04，P=0.000）；实验组高于各对照组，为阴性对照组的2.36（P＜0.05）；与阴性对照组相比，生理盐水及空白对照组NKX2.1mRNA相对表达量无显著差别（P＞0.05，P＞0.05）。实验组肺组织NKX2.1蛋白表达高于各对照组（均P＜0.05）。 5.SPC mRNA和蛋白表达：四组间SPC mRNA相对表达量差异有显著性（F=9.22，P=0.000）；实验组高于各对照组，为阴性对照组的1.78（P＜0.05）；与阴性对照组相比，生理盐水及空白对照组SPC mRNA相对表达量无显著差别（P＞0.05，P＞0.05）。实验组肺组织SPC蛋白表达高于各对照组（均P＜0.05）。 6.AQP5mRNA和蛋白表达水平：四组间AQP5mRNA相对表达量差异有显著性（F=12.94，P=0.000）；实验组高于各对照组，为阴性对照组的2.00（P＜0.05）；与阴性对照组相比，生理盐水及空白对照组AQP5mRNA相对表达量无显著差别（P＞0.05，P＞0.05）。实验组肺组织AQP5蛋白表达高于各对照组（均P＜0.05）。 结论： 采用腺病毒介导的NANCI干扰技术成功构建新生小鼠BPD模型，而腺病毒介导的过表达NANCI对高氧诱导新生小鼠BPD肺组织具有明显的保护作用，提示NANCI-NKX2.1信号通路在BPD新生小鼠中可能起重要作用。

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文献综述

LncRNA的作用机制及与肺部疾病相关研究进展