过表达DDC,TH和GCH1重组慢病毒构建及其在帕金森大鼠模型治疗作用的探究

摘要

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是世界上常见的神经系统退行性疾病，随着年龄增加，其发病率逐渐增高。PD主要病理改变是黑质致密部(substantia nigra pars compacta,Snc)内多巴胺(dopamine,DA)能神经元减少，从而导致Snc-纹状体通路中DA释放减少。PD病因和致病机制目前尚不清楚，其并非单一因素所致，而是年龄、环境、遗传等因素交互作用的结果。目前临床上无药物能够减缓阻止及逆转DA能神经元变性过程。无论是药物治疗，还是手术治疗，都不能根治PD，且会产生明显副作用。 PD主要病变是Snc部DA能神经元丢失导致纹状体内DA水平下降，且PD患者脑中病变部位明确，因此PD成为神经系统病变中进行基因治疗热门病种。本文中，通过构建过表达多巴胺脱羧酶(dopamine decarboxylase,DDC)、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate,GTP)环化水解酶(GTP cyclihydrolase1,GCH1)的重组慢病毒(recombinant lentivirus,rLV)，将DDC+TH+GCH1-rLV注射至6-羟基多巴(6-hydroxydopamine,6-OHDA)制备的PD模型大鼠纹状体中，观察病毒在PD大鼠脑内的表达情况及大鼠的旋转行为学改变。采用携带产酶基因重组病毒载体,在动物模型中进行治疗，拟重建纹状体DA水平，以期待达到预期治疗效果。 第一部分 过表达DDC,TH和GCH1rLV及对照rLV制备及鉴定 目的：构建DDC+TH+GCH1-rLV及对照rLV载体。 方法：PCR扩增各目的基因片段DDC、SV40early promoter、TH、mPGK promoter、GCH1，使用BamHI-HF和XhoI对载体pMT174(pLV-RSV-CMV-WPRE)进行酶切，回收载体片段备用。进而在无缝反应液作用下，将各目的片段与回收后的线性化表达载体进行同源重组。利用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序，测序无误后进行质粒提抽。最后目的质粒与辅助质粒pCMV-dR8.9、pCMV-VSV-G共转染HEK293T细胞进行病毒包装，经纯化、浓缩后保存备用。取样进行RT-PCR滴度测定。取出DDC+TH+GCH-rLV及对照rLV冰上融化，感染HEK293T细胞。72h后，提取总蛋白，对DDC、TH、GCH1进行Western blot检测。 结果：PCR结果显示，在1429bp、412bp、1614bp、551bp、791bp处可见特异性目的基因DDC，SV40early promoter，TH，mPGK promoter，GCH1目的基因条带；使用BamHI-HF和XhoI对工具载体pMT174进行酶切，回收6508bp载体片段；菌落PCR转化子鉴定结果显示，阳性克隆得到1436bp片段；测序结果正确；与辅助质粒共转染HEK293T细胞，72小时后获得DDC+TH+GCH1-rLV和对照rLV颗粒，经过纯化浓缩后-80℃保存备用。取样进行RT-PCR滴度测定，分别为5.56×108v·g·mL-1、1.07×109v·g·mL-1。Western blot结果可见，DDC+TH+GCH1-rLV感染组在3种DDC、TH和GCH1蛋白相对分子质量处可见特异性的蛋白分子表达条带。 结论：成功构建DDC+TH+GCH1-rLV及对照rLV，其浓度及所携带基因功能满足后续实验需要。 第二部分 过表达DDC,TH和GCH1rLV在PD大鼠模型中的作用探究 目的：评价DDC+TH+GCH1-rLV对PD大鼠模型的治疗效果，检测目的基因是否正确表达。 方法：大鼠6-OHDA MFB两点法立体注射，构造单侧损毁PD模型。挑选完全损伤模型，其标准为旋转圈数每分钟＞7圈，或30分钟＞210圈。运用Snc部TH免疫荧光，检测PD大鼠DA能神经元损毁情况。24只PD大鼠模型分为随机分为三组：生理盐水组(n=6)、阴性病毒组(n=6)和阳性病毒组(n=12)，分别经立体定向向大鼠纹状体三点注射生理盐水、对照rLV和DDC+TH+GCH1-rLV。观察构建病毒对PD大鼠旋转行为的影响，免疫荧光法检测病毒转染情况，同时使用高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)检测纹状体内DA及其代谢产物改变情况。 结果：6-OHDA MFB两点法立体注射构建PD大鼠模型，符合PD大鼠旋转行为标准，挑选PD模型大鼠。PD大鼠Snc部TH免疫荧光结果显示：损毁侧DA能神经元大量丢失(P＜0.01)，行为学观察及免疫荧光检测证明PD模型构建成功。PD大鼠纹状体注射后，阳性病毒组行为改变与生理盐水组、阴性病毒组比较，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；阳性病毒组呈现出显著的旋转行为改善。免疫荧光显示阳性病毒转染表达有TH活性的阳性细胞。阳性病毒组纹状体内DA及其代谢产物与生理盐水组、阴性病毒组间比较，显著增高(P＜0.01)。 结论：DDC+TH+GCH1-rLV在PD模型大鼠中呈现出显著的行为改善，DA水平增加及稳定的目的基因表达。

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第一部分过表达DDC, TH和GCH1 rLV及对照rLV制备及鉴定

材料与方法

第二部分过表达DDC, TH和GCH1 rLV在PD大鼠模型治疗作用的探究