HIF-1α调控PTP4A3对苯致骨髓造血毒性的影响

摘要

苯主要通过呼吸道进入人体，短期吸入高浓度苯会引起急性苯中毒，长期暴露于低浓度的苯可致慢性苯中毒，影响人体骨髓的造血功能。缺氧诱导因子（HIF-1α）是调控造血干细胞的代谢及生理功能的一类转录因子，HIF-1α有利于维持造血干细胞静止状态和长期增殖能力。本研究通过构建小鼠苯中毒模型，研究HIF-1α对苯中毒造血毒性的调控，通过ChIP-Seq分析，筛选HIF-1α调控细胞增殖相关的基因PTP4A3并对其调控的作用机制进行验证，从而为HIF-1α在苯致骨髓造血毒性调节作用机制提供线索，为寻找慢性苯中毒造血毒性新的生物标志物提供科学的理论依据。 第一章 HIF-1α对苯致骨髓造血毒性的作用 构建HIF-1α高表达的C57BL/6小鼠（C57BL/6-HIF-1α+小鼠），使用C57BL/6和C57BL/6-HIF-1α+雄性小鼠暴露于0mg/(kg.d)、150mg/(kg.d)剂量的苯构建小鼠苯中毒模型，染毒结束分析小鼠体重、脏器系数、外周血血常规及造血系统变化等。 结果显示C57BL/6-HIF-1α+小鼠模型构建成功，C57BL/6-HIF-1α+小鼠骨髓细胞HIF-1α蛋白表达水平明显高于C57BL/6小鼠。C57BL/6和C57BL/6-HIF-1α+小鼠苯暴露后，肝体比、脾体比、肺体比以及外周血白细胞、红细胞、血小板较对照组降低。流式结果显示苯暴露后C57BL/6-HIF-1α+小鼠骨髓LSK细胞比例降低幅度、LSK细胞早期凋亡比例增加幅度较C57BL/6小鼠低，C57BL/6-HIF-1α+小鼠对照组LSK细胞DNA复制活性较C57BL/6小鼠对照组增加。苯暴露组C57BL/6和C57BL/6-HIF-1α+小鼠骨髓细胞HIF-1α蛋白水平较对照组降低。 以上结果表明相对于C57BL/6小鼠，HIF-1α高表达小鼠的苯造血毒性较弱，其机制可能与HIF-1α维持造血干细胞的增殖作用有关，提示HIF-1α高表达对骨髓造血干细胞的自我更新与生存维持有积极作用。 第二章 应用苯暴露小鼠骨髓细胞筛检HIF-1α调控的细胞增殖相关靶基因 使用C57BL/6小鼠苯暴露组和对照组小鼠骨髓细胞，通过染色质免疫共沉淀测序技术（ChIP-Seq），筛选HIF-1α调控的细胞增殖相关靶基因，并对HIF-1α及其响应基因的结合水平、转录及翻译水平进行验证。 ChIP-Seq结果显示苯暴露组在启动子区的富集峰有353个上调和245个下调。在245个下调的基因中，通过UCSC数据库，查找差异富集区的基因序列中含有HIF-1α特异性结合位点HRE（aCGTG/gCGTG）的基因共42个，其中有GO基因功能标注的基因有25个。小鼠骨髓细胞mRNA结果显示25个基因中有11个基因在苯暴露组较对照组显著下调。C hIP-qPCR结果表明，苯暴露组小鼠骨髓细胞HIF-1α抗体富集到的PTP4A3的表达量是对照组的0.03倍。在GO基因功能中选取增殖相关的基因PTP4A3，PTP4A3的蛋白水平在苯暴露组的C57BL/6小鼠骨髓细胞内较对照组下调，在C57BL/6-HIF-1α+小鼠骨髓细胞内较对照组小鼠上调。 以上结果表明ChIP-Seq可以有效筛选出转录因子HIF-1α与其结合的响应基因，ChIP-qPCR结果证实了苯暴露组HIF-1α与PTP4A3的结合水平低于对照组，PTP4A3与HIF-1α在mRNA和蛋白水平上的变化一致，因此确认PTP4A3是HIF-1α的靶基因。 第三章 PTP4A3对1,4-苯醌致K562细胞毒性调控作用的功能验证研究 设计针对PTP4A3基因低表达的慢病毒，感染K562细胞构建PTP4A3低表达的K562细胞株（K562-PTP4A3-）和阴性对照细胞（K562-NC），用1,4-苯醌处理后检测细胞中PTP4A3的表达，以及细胞增殖抑制情况、DNA复制活性、细胞的DNA损伤、细胞凋亡率、细胞周期分布及细胞内RO S水平变化。 RT-PCR结果显示，K562-PTP4A3-细胞中PTP4A3mRNA相对表达量较K562-NC细胞降低了90%，表明K562-PTP4A3-细胞模型构建成功。在0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L1,4-苯醌作用下，K562-PTP4A3-细胞相对增殖率、DNA复制活性均明显低于K562-NC细胞，20μmol/L的1,4-苯醌染毒组K562-PTP4A3-细胞早期凋亡比例高于K562-NC细胞。周期结果显示，1,4-苯醌染毒使K562-NC细胞周期阻滞在S期，K562-PTP4A3-细胞周期阻滞在G2/M期。1,4-苯醌染毒使K562-NC及K562-PTP4A3-细胞内ROS含量、Olive尾矩较对照组升高。WB结果显示，0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的1,4-苯醌处理K562-PTP4A3-和K562-NC细胞，PTP4A3蛋白及PI3K/AKT通路蛋白表达均下降。 以上结果提示PTP4A3低表达可以增加1,4-苯醌对K562细胞的增殖损伤和促凋亡作用，而PI3K/AKT通路关键蛋白的变化表明PI3K/AKT通路在1,4-苯醌作用于K562细胞的过程中被抑制，提示PTP4A3低表达可能通过抑制PI3K/AKT通路调控细胞增殖功能。 第四章 慢性苯中毒小鼠骨髓及外周血中PTP4A3的表达的研究 使用0mg/(kg.d)、6mg/(kg.d)、30mg/(kg.d)、150mg/(kg.d)剂量的苯暴露于C57BL/6小鼠，分析小鼠慢性苯暴露的一般毒性并检测骨髓细胞、LSK细胞、外周血白细胞中PTP4A3的表达量。 结果显示，6mg/(kg.d)、30mg/(kg.d)、150mg/(kg.d)的苯暴露组小鼠体重增加缓慢，显著低于对照组小鼠；苯暴露组小鼠白细胞的计数、红细胞数量以及血红蛋白的含量均较对照组小鼠降低，150mg/(k g.d)的苯暴露组小鼠降低显著，且白细胞的计数与苯的浓度呈现出剂量-反应关系。RT-PCR结果发现小鼠骨髓细胞、LSK细胞和外周血白细胞在苯暴露后PTP4A3的表达量均低于对照组，150mg/(kg.d)的苯暴露组小鼠降低显著。 以上结果表明本章构建苯中毒小鼠模型成立，苯暴露显著降低小鼠的体重及白细胞数量，且白细胞计数与苯浓度呈剂量-反应关系。苯暴露组小鼠骨髓细胞、LSK细胞和外周血白细胞中PTP4A3的表达量均低于对照组小鼠，提示PTP4A3作为慢性苯中毒生物标志物潜在的可能性。 总结： 1.成功构建HIF-1α高表达的转基因小鼠C57BL/6-HIF-1α+小鼠。通过建立苯中毒小鼠模型，发现相对于C57BL/6小鼠，C57BL/6-HIF-1α+小鼠苯造血毒性较弱，表明HIF-1α对骨髓造血干细胞的自我更新与生存维持有积极作用。 2.成功利用ChIP-Seq技术筛选出HIF-1α的响应基因。多重验证了HIF-1α及其调控的响应基因之间的相互关系，苯暴露组HIF-1α与PTP4A3的结合水平显著低于对照组，由此确定了HIF-1α调控的增殖相关的靶基因PTP4A3。 3.成功建立了PTP4A3低表达的K562细胞模型K562-PTP4A3-细胞及其阴性对照细胞K562-NC细胞。通过细胞生物学功能的实验研究，发现PTP4A3在1,4-苯醌染毒K562细胞过程中，主要调控细胞的增殖功能。信号通路蛋白研究发现PTP4A3低表达通过抑制下游PI3K/AKT信号通路调控细胞的增殖作用。 4.探索了PTP4A3作为苯中毒生物标志物的潜在可能性。

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