正常体重、超重和肥胖儿童肠道菌群差异研究

摘要

本研究运用高通量测序技术对正常体重、超重和肥胖儿童肠道微生物的16Sr DNA进行测序，比较其微生物群落的物种多样性和群落组成差异；应用实时荧光定量PCR技术对三组儿童肠道内的直肠真杆菌、多形拟杆菌、双歧杆菌属和乳酸杆菌进行特异性扩增，比较它们在不同体重儿童肠道中的数量差异。结合以上两部分研究，形成对肥胖儿童肠道微生态结构的全面认识，分析肥胖儿童肠道菌群变化特点，探索肠道菌群与肥胖的关系，以期为通过调节肠道菌群防治肥胖提供理论依据。 目的： 1.比较正常体重、超重和肥胖儿童肠道菌群物种多样性和群落构成，分析不同体重儿童肠道菌群是否存在差异性。 2.比较正常体重、超重和肥胖儿童肠道中直肠真杆菌、多形拟杆菌、双歧杆菌属和乳酸杆菌数量，分析不同体重儿童肠道中这些种属的数量差异。 方法： 1.采集30例正常体重、35例超重和35例肥胖儿童粪便并提取DNA，然后对16S rDNA V4区进行扩增，使用Illumina-HiSeq高通量测序平台进行测序，运用生物信息学技术对结果进行分析，比较三组菌群丰度和物种多样性，寻找组间有显著差异的物种。 2.采集54例正常体重、53例超重和59例肥胖儿童粪便并提取DNA，根据待测菌的16S rDNA基因序列设计四种菌的特异性引物，进行实时荧光定量PCR反应，比较三组间四种菌的数量有无差异。 结果： 1.通过高通量测序，三组共获得了4320570条优质序列。Alpha多样性分析结果表明，三组的多样性指数中observed_species、Chao1指数和PD whole tree组间差异有统计学意义（P＜0.05），而Shannon指数和Simpson指数在不同体重组间的差异没有统计学意义（P＞0.05）。Beta多样性分析结果表明，正常体重和肥胖儿童肠道菌群组成差异显著（P＜0.05），而超重与正常体重和肥胖儿童肠道菌群结构组成差异较小（P＞0.05）。具体来看，单型拟杆菌（Bacteroides uniformis）、拟杆菌门S24-7科、霍尔德曼氏菌（Holdemania）、吉利蒙德(氏)颤螺菌（Guilliermondii）、克里斯滕森氏菌属（Christensenella）、消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）、巨球型菌属（Megasphaera）、梭菌属（Clostridium）、哈氏梭菌（Clostridium hathewayi）、厌氧棍状菌属（Anaerotruncus）、柔膜菌门（Tenericutes）、柔膜菌纲（Mollicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、红椿杆菌纲（Coriobacteriia）、红椿杆菌目（Coriobacteriales）、红椿杆菌科（Coriobacteriaceae）、柯林斯菌属（Collinsella）、产气柯林斯菌（Aerofaciens）、青春双岐杆菌（Bifidobacterium.adolescentis）、草酸杆菌科（Oxalobacteraceae）、产甲酸草酸杆菌（Formigenes）、δ变形菌纲（Deltaproteobacteria）、脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）、脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）为正常体重组的主要菌群。普雷沃氏菌属[Prevotella]和克里斯滕森氏科（Christensenellaceae）在超重组显著增加。变形菌门（Proteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）、产碱杆菌科（Alcaligenaceae）、萨特氏菌属（Sutterella）、巴斯德氏菌目（Pasteurellales）、巴斯德氏菌科（Pasteurellaceae）、杆菌属（Aggregatibacter）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、副流感嗜血杆菌（Parainfluenzae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、普雷沃氏菌属（Prevotella）、Prevotella.copri菌、Prevotella.stercorea菌、梭杆菌门（Fusobacteria）、梭杆菌纲（Fusobacteriia）、梭杆菌目（Fusobacteriales）、梭杆菌科（Fusobacteriaceae）、梭杆菌属（Fusobacterium）、纤毛菌科（Leptotrichiaceae）、纤毛菌属（Sneathia）、粪拟杆菌（Bacteroides coprophilus）、埃氏拟杆菌（Bacteroides.eggerthii）、韦荣球菌属（Veillonella）、殊异韦荣球菌（Veillonella.dispar）、巨单胞菌属（Megamonas）、活泼瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）、规则粪球菌（Coprococcus eutactus）、隐藏梭菌（Celatum）、产气荚膜梭菌（Perfringens）、瘤胃乳杆菌（Lactobacillus ruminis）在肥胖组显著增加。 2.直肠真杆菌、多形拟杆菌、双歧杆菌属和乳酸杆菌在三组间的差异均有显著性（P＜0.01）。直肠真杆菌在正常体重、超重和肥胖组的中位数分别是6.50（QR5.83-7.02）、6.79（QR6.28-7.38）和7.34（QR6.91-7.78）。多形拟杆菌在正常体重、超重和肥胖组的中位数分别是5.00（QR4.93-5.74）、4.77（4.69-5.44）和4.79（QR4.69-5.36）。双歧杆菌属在正常体重、超重和肥胖组的中位数分别是8.31（QR8.18-8.54）、8.31（QR8.11-8.47）和7.33（QR7.16-7.57）。乳酸杆菌在正常体重、超重和肥胖组的中位数分别是6.12（QR5.90-6.32）、5.85（QR5.70-5.97）和5.29(QR5.01-5.63)。 结论： 1.随着体质量的增加，物种的丰度显著降低。多样性指数在三组间未见明显差异。正常体重组和肥胖组菌群组成存在显著性差异，但超重组与正常体重组和肥胖组均存在一定的相似性，三组中一些特定菌群的比例发生了变化。 2.直肠真杆菌的增加，多形拟杆菌、双歧杆菌属和乳酸杆菌的减少可能与超重和肥胖的发生发展有关。正常体重、超重和肥胖儿童肠道中直肠真杆菌、多形拟杆菌、双歧杆菌属和乳酸杆菌的数量受性别和年龄影响较小。

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