驽巴贝斯虫BC-48基因片段在大肠杆菌中的表达与初步应用

摘要

驽巴贝斯虫(Babesia caballi)是一种经蜱传播的血液原虫，可引起马属动物发热、贫血、黄疸和水肿，严重的可致死。该病被世界动物卫生组织(OIE)列为B类疫病，给养马业造成了巨大的经济损失。驽巴贝斯虫管状蛋白主要起到侵入红细胞的作用，是抗驽巴贝斯虫裂殖子疫苗的候补蛋白。BC-48基因编码驽巴贝斯虫裂殖子管状蛋白，而且是该虫属比较重要的保守基因。 本研究利用PCR技术扩增和克隆了610 bp驽巴贝斯虫中国吉林株BC-48基因片段，对所克隆的BC一48基因序列与基因库中已发表的序列(U46551)进行比较分析。结果表明同源性达到97.1％，证明了该基因片段为驽巴贝斯虫BC-48基因。将BC-48基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2，经酶切鉴定及PCR鉴定，证明成功构建了融合表达载体pGEX-BC48。将构建好的融合表达载体，在1mmol/L的IPTG诱导下，在大肠杆菌BL21中得到大量表达，经过8 h表达量达到高峰。融合蛋白GST-BC48的分子量为45 ku，大部分以可溶性蛋白的形式存在。用亲和层析方法对GST-BC48融合蛋白进行了纯化，获得了理想的纯化结果。 Western-bloting免疫印记分析，融合蛋白与驽巴贝斯虫阳性血清发生特异性反应，而同马巴贝斯虫阳性血清没有交叉反应。说明该蛋白具有很好的抗原性和特异性。 本研究应用纯化后的GST-BC48融合蛋白建立了检测驽巴贝斯虫抗体的间接ELISA方法。结果表明，抗原浓度为2.5μg/mL、被检血清稀释度为1：160、酶标二抗稀释度为1：4000为最佳工作浓度。该方法不与新孢子虫、弓形虫、马巴贝斯虫等阳性血清发生交叉反应，具有较好的特异性；该方法与玄学南等建立的间接ELISA方法平行检测132份马血清样本，结果表明，所建立方法更加敏感。说明建立的ELISA适用于驽巴贝斯虫抗体的检测。

目录

文摘

英文文摘

前言

1试验材料

1.1病料

1.2载体与菌株

1.3主要试剂

1.4试验所用溶液及其配制

1.5主要仪器设备

2试验方法

2.1驽巴贝斯虫基因组DNA的制备

2.2引物的设计与合成

2.3目的基因的PCR扩增

2.4 PCR产物的回收

2.5感受态细胞的制备(CaCl2法)

2.6 BC-48 DNA与pGEM-T Easy载体的重组连接

2.7重组连接后质粒DNA的转化

2.8重组克隆的筛选

2.9质粒DNA的小量制备(碱性裂解法)

2.10重组质粒的鉴定

2.11序列测定及分析

2.12重组表达载体的构建

2.13重组表达载体的鉴定

2.14重组融合表达质粒的诱导表达

2.15 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.16融合蛋白Western-blotting分析

2.17重组蛋白的大量表达

2.18包涵体的鉴定

2.19亲和层析法纯化融合蛋白(Batch法)

2.20 BC-48融合蛋白的初步应用——ELISA试验

3试验结果

3.1 PCR扩增

3.2目的基因的克隆及重组质粒的鉴定

3.3 BC48-easy重组质粒的序列测定及同源性分析

3.4重组表达载体的构建及鉴定

3.5重组表达质粒的序列测定及分析

3.6重组表达载体pGEX-BC48的表达

3.7融合蛋白Western-blotting分析

3.8蛋白存在形式的鉴定

3.9重组蛋白的亲和层析纯化

3.10以重组BC-48蛋白为抗原的ELISA试验

4讨论

4.1驽巴贝斯虫病的诊断

4.2 BC-48基因片断的克隆与扩增

4.3酶切鉴定

4.4影响外源基因在大肠杆菌中高效表达的因素

4.5高效融合表达载体pGEX-4T-2的选择

4.6 BC-48重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达

4.7 Western-blotting检测重组蛋白的特异性

4.8以重组BC-48蛋白为抗原的ELISA试验

5结论

参考文献

致谢

作者简介

附录