Dot-ELISA检测牛D型产气荚膜梭菌病抗体的研究

摘要

产气荚膜梭菌（Cl.perfringens）是一种梭状芽孢属条件性致病菌，该病广泛分布于自然界，在一定条件下，可引起严重的犊牛肠毒血症,甚至死亡。而针对该病菌体蛋白产生的特异抗体尚无一套完整的血清学检测方法。因此，本研究目的是以纯化的菌体蛋白建立一种快速、准确、敏感的血清学诊断方法。
　　本试验成功地以Cl.perfringens D型标准株C60的菌体经过超声波裂解后，进行了SephadexG-200凝胶柱纯化、SDS-PAGE和Western blot分析，提纯的140KD大小的Cl.perfringens菌体蛋白与牛血清中D型Cl.perfringens抗体具有良好的特异性反应。因此，纯化后的Cl.perfringens140KD菌体蛋白可以用于建立牛D型Cl.perfringens病间接Dot-ELISA的诊断抗原。
　　本试验对间接Dot-ELISA的反应条件进行了优化，确定了最适工作条件。结果表明，试验流程中最适抗原包被浓度1.95μg/mL、最适血清稀释度1:320及最适酶标兔抗牛IgG的工作浓度1:2000；采用Dot-ELISA检测同一份1:320倍稀释的阳性血清抗体时粗提抗原的浓度为40.6μg/mL时，而提纯抗原的浓度仅为1.9μg/mL；应用提纯抗原的Dot-ELISA对100份牛血清进行检测，敦化地区阳性率最高；用二抗体间接Dot-ELISA和AGID同时检测30份阳性血清的抗体滴度，结果二法所测抗体平均滴度分布为1:736和1:17，间接Dot-ELISA的相对灵敏度为AGID的43倍；而且所建立的二抗体间接Dot-ELISA不与牛产气荚膜梭菌病A、B、C、E型阳性血清反应，表明该法具有较高的特异性。
　　本试验在国内首次应用纯化的D型Cl.perfringens菌体蛋白为抗原，成功建立了检测牛血清中D型Cl.perfringens抗体的间接Dot-ELISA诊断方法，所建立的Dot-ELISA法除了具有ELISA的高度特异性和敏感性之外，还具有抗原用量少，快速、简便等优点，为牛产气荚膜梭菌病诊断和预防提供了一种可靠的试验手段。

目录

声明

引言

1 病原体简介

2 毒素

3 流行病学及其临床特征

4 产气荚膜梭菌对人类的危害

5 产气荚膜梭菌诊断方法研究进展

6 防治措施

7 本课题研究的目的和意义

材 料 与 方 法

1 材料

2 方 法

结果

1D型产气荚膜梭菌培养

2D型产气荚膜梭菌生长曲线测定

3D型产气荚膜梭菌抗原分析

4 D型产气荚膜梭菌纯化菌体抗原SDS-PAGE分析

5 纯化菌体抗原Western blot分析

6 Dot-ELISA反应判定标准

7 Dot-ELISA程序的标准化

8 不同载体的比较

9 特异性试验

10 敏感性试验

11 重复性试验

12 比较试验

13 间接Dot-ELISA对血清样本检测

14 膜片保存期试验

讨论

1 间接Ｄot-ELISA方法诊断抗原的选择

2 Dot-ELISA试验的操作及中间环节对试验质量影响

3 血清滴度及反应孵育温度对试验质量的影响

4 抗原浓度及封闭液选择对试验质量的影响

5 提纯抗原检测牛血清样本的前带现象

6 本研究所建立的抗体诊断方法的特点

结论

参考文献

致谢

作者简介

附录（攻读学位期间发表论文目录）