牛瑟氏泰勒虫环介导等温扩增检测的相关研究方法的建立及应用

摘要

牛瑟氏泰勒虫病是由泰勒科、泰勒属的瑟氏泰勒虫（T. sergenti）寄生于牛红细胞和淋巴细胞引起的以高热、贫血、出血、消瘦和体表淋巴结肿大为主要临床症状的一种血液原虫病。该病危害极为严重，可使病牛出现严重贫血、黄染和消瘦，母牛产后少奶或无奶，出生的小牛瘦弱、存活率低等症状，已给养牛业造成了巨大的经济损失。
　　本研究以高度保守的表面蛋白P33基因序列的一部分作为靶序列，通过PrimerExplorer3.0软件设计LAMP引物。对试验中温度、镁离子浓度、内外引物浓度比和反应时间等重要参数进行优化，建立了牛瑟氏泰勒虫P33基因的LAMP检测方法，并进行了应用研究。结果表明，外引物浓度不变时，在镁离子浓度为8mM和10mM，内引物浓度为1.2μM-1.6μM时效果最好；以63℃作为参数，外引物终浓度0.2μM，经限制性内切酶ScaⅠ消化后出现114bp和129bp2条主带；时间梯度结果显示，最佳反应时间为45min或60min。对梯度稀释模板的检测表明，T.S P33-LAMP最低检测量为0.23fg/μl，而普通PCR法只能检测到23fg/μl；以弓形虫、新孢子虫、卵形巴贝斯虫为模板未扩增出条带，说明该法具有较好的特异性；通过对4个地区84份牛血液样本的临床应用表明，4个地区均为牛瑟氏泰勒虫感染地区，阳性率最高达85.71％，不同性别间感染率差异显著(P<0.05)，不同地区间差异极显著（P<0.01）。本试验建立的牛瑟氏泰勒虫LAMP检测方法具有快速、敏感性高、特异性强、稳定性好等特点，完全适用于牛瑟氏泰勒虫病的诊断，为牛瑟氏泰勒虫LAMP诊断试剂盒的研制奠定了基础。

目录

声明

前言

1 牛瑟氏泰勒虫病概况

2 牛瑟氏泰勒虫病原学

3 牛瑟氏泰勒虫病流行病学

4 牛瑟氏泰勒虫病临床症状

5 牛瑟氏泰勒虫病病理变化

6 牛瑟氏泰勒虫病诊断技术

7 牛瑟氏泰勒虫病防治

8 本课题的研究目的和意义

1 材 料

1.1 血样来源

1.2 特异性试验虫株来源

1.3 试剂及载体

1.4 主要仪器

1.5 主要试剂的配置

2 方 法

2.1 LAMP和普通PCR引物

2.2 牛瑟氏泰勒虫基因组DNA的提取

2.3 目的基因LAMP和普通PCR扩增

2.4 LAMP与PCR产物的鉴定

2.5 LAMP扩增产物的酶切鉴定

2.6 反应中镁离子浓度的筛选

2.7 反应温度的优化

2.8 反应时间的筛选

2.9 内外引物浓度比的筛选

2.10 特异性试验

2.11 敏感性试验

2.12 重复性试验

2.13 环介导等温扩增方法的应用

结果

1 LAMP与普通PCR扩增产物的检测结果

2 LAMP扩增产物的酶切鉴定

3 镁离子浓度的筛选试验

4 LAMP扩增温度的筛选试验

5 反应时间的筛选试验

6 内外引物浓度比的筛选试验

7 特异性反应

8 敏感性试验结果

9 重复性试验

10 环介导等温扩增方法的应用结果

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

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