弓形虫GRA3基因的原核表达及单克隆抗体的制备与初步应用研究

摘要

弓形虫病(toxoplasraosis)，又称弓形体病，它是由一种球虫，即弓形体(Toxoplasmagandii)所引起的一种寄生原虫病。弓形虫体内存在一种重要的分泌抗原致密性颗粒蛋白，经临床人体和动物试验结果显示，致密性颗粒蛋白的反应原性和免疫原性均很高，而目前对 GRA3抗原的研究显示，该抗原可以诱发机体产生体液免疫，所以该抗原对于将来用于该病的临床诊断及其疫苗的研究均具有很大价值。本研究旨在成功构建致密性颗粒蛋白 GRA3（Dense granle protein GRA3）原核表达载体，进一步利用表达的重组GRA3蛋白抗原制备抗重组 GRA3的单克隆抗体，并进行单克隆抗体的鉴定及应用，进一步的研究该抗原的应用价值，为弓形虫病的诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础。
　　本研究根据GenBank AF414079已发表的弓形虫GRA3基因序列设计了一对特异性的引物，利用PCR技术成功扩增出了一段687bp的基因片段，对该基因进行了序列分析，结果显示该基因片段为弓形虫GRA3基因；并成功构建了原核表达载体pGEX-GRA3；将构建好的表达载体，经IPTG诱导，在大肠杆菌BL21中进行了表达，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，获得了分子量为50ku的融合蛋白GST-GRA3，经分析大部分以可溶性蛋白的形式存在。Western-Blotting免疫印迹分析，该重组蛋白与弓形虫阳性血清发生特异性反应，说明该蛋白具有一定的反应原性。
　　为进一步探讨重组蛋白作为诊断抗原的可能性。本研究利用高效表达的重组GRA3蛋白免疫BALB/c小鼠，采用细胞融合技术，经间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆后获得一株抗重组GRA3蛋白的杂交瘤细胞株（5E4）。经鉴定，其McAb的亚型为IgG1型。ELISA和western blotting试验结果表明，获得的5E4 McAb可特异性的识别弓形虫GRA3蛋白，表明5E4 McAb识别的表位可能位于GRA3蛋白的保守区域。
　　并以兔抗弓形虫IgG为捕获抗体，利用抗重组GRA3蛋白单克隆抗体为检测抗体，成功建立了用于弓形虫病检测的单抗双夹心ELISA方法，该方法对弓形虫检病检测灵敏度达0.154ug/m L。用该法对延边某猪场152头猪进行检测，结果阳性率为13.2％。并与常规ELISA相比较，该法更加敏感、特异，更有利于准确诊断。为临床研制弓形虫诊断试剂、治疗试剂奠定了基础，为制备疫苗的候选基因的筛选提供依据，同时为弓形虫的检测和区域流行病学调查提供了一种简便快速的诊断方法。

目录

声明

第一章 绪 论

1 弓形虫病原学国内外的研究情况

2 弓形虫病流行病学研究进展

3 弓形虫抗原基因的研究进展及在疾病诊断中的应用情况

4 PCR技术在弓形虫病诊断中研究进展

5 芯片技术在弓形虫诊断中研究进展

6 弓形虫疫苗的研究进展

7 单克隆抗体技术在疾病诊断中的应用

8 弓形虫病在防治方面的研究进展

9 本研究目的及意义

第二章 弓形虫GRA3基因原核表达的研究

1材料

2 方法

3 结 果

4 讨 论

5 小 结

第三章 抗重组蛋白GRA3单克隆抗体的制备与分析

1 材料

2 方法

3 结 果

4 讨 论

5 小结

第四章 单抗双夹心ELISA检测方法的建立与初步应用

1材料

2 方法

3 结 果

4 讨 论

5 小结

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文