牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7复合基因核酸疫苗与重组腺病毒疫苗的研究

摘要

新孢子虫病是严重危害养牛业健康发展的重要繁殖障碍性疾病，该病可垂直传播，带虫母牛可将虫体直接传给新生犊牛，随着我国养牛业的发展和牛的频繁交易，该病在我国的流行区域逐渐扩大。目前，国内外对新孢子虫病的研究都局限在病原学、分子生物学、流行病学、诊断和免疫学方面，但对新孢子虫病的防控尚无有效的方法。因此，本研究提取牛源犬新孢子虫基因组DNA，应用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS2和致密颗粒蛋白基因NcGRA7，SOE-PCR技术拼接NcSRS2和NcGRA7基因，构建NcSRS2-NcGRA7复合基因重组克隆质粒、重组真核质粒、重组腺病毒穿梭质粒及重组腺病毒，制备NcSRS2-NcGRA7复合基因核酸疫苗和重组腺病毒疫苗，应用Prime-Boost免疫策略及单一疫苗分别接种BABL/c小鼠，测定体液免疫和细胞免疫应答水平，并进行攻虫试验，评价免疫保护性，以期为牛的新孢子虫病新型疫苗的研究奠定基础。
　　1、牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7复合基因的克隆与生物信息学分析
　　提取牛源犬新孢子虫基因组DNA，应用PCR技术扩增犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS2和致密颗粒蛋白基因NcGRA7，SOE-PCR技术拼接NcSRS2和NcGRA7基因，构建NcSRS2-NcGRA7复合基因重组克隆质粒，并进行PCR鉴定、双酶切鉴定及生物信息学分析。结果，NcSRS2基因扩增片段大小为1061 bp，NcGRA7基因扩增片段大小为364 bp，NcSRS2-NcGRA7复合基因扩增片段大小为1482 bp；获得重组克隆质粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7经PCR鉴定、双酶切鉴定正确；测序分析表明，与GenBank中已发表的美国株犬新孢子虫（AF061249、AF176649）核苷酸序列同源性为99％；经DNAman等软件分析，预测NcSRS2-NcGRA7复合蛋白抗原指数较高，复合蛋白二级结构以α-螺旋和β-折叠为主，三级结构中两种蛋白独立折叠，并借助Linker互相连接，功能互不影响。
　　2、NcSRS2-NcGRA7复合基因核酸疫苗的构建
　　重组克隆质粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7与pVAX1真核表达载体同时进行EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后，构建重组真核表达质粒pVAX1-NcSRS2-NcGRA7，将PCR鉴定和酶切鉴定正确的重组真核表达质粒脂质体介导转染Vero细胞，应用RT-PCR、IFAT及Western blotting技术鉴定pVAX1-NcSRS2-NcGRA7重组质粒在Vero细胞中的表达。结果，构建重组真核表达质粒pVAX1-NcSRS2-NcGRA7经PCR鉴定和酶切鉴定正确，并能够在Vero细胞中表达。扩增、纯化重组质粒制备NcSRS2-NcGRA7复合基因核酸疫苗。
　　3、NcSRS2-NcGRA7复合基因重组腺病毒疫苗的构建
　　重组克隆质粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后，亚克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中，构建pCR259-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒穿梭质粒，将PCR鉴定和酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒穿梭质粒依次转化HighQ-1 Transpose-Ad294和HighQ-1感受态细胞，进行同源重组与纯化，构建NcSRS2-NcGRA7复合基因重组腺病毒表达质粒，PacⅠ酶切线性化后，脂质体转染QBI-HEK293细胞包装Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒。结果，经PCR检测，构建的重组腺病毒含有NcSRS2-NcGRA7复合基因；经IFAT和Western blotting检测，NcSRS2-NcGRA7复合基因在QBI-HEK293细胞中获得表达。测得Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒滴度为109 TCID50/mL。
　　4、NcSRS2-NcGRA7复合基因疫苗的Prime-Boost免疫策略研究
　　80只BALB/c小鼠随机分为4组，每组20只，分别为Prime-Boost免疫策略组（核酸疫苗初免，重组腺病毒疫苗二免、三免）、Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组及PBS对照组。每隔2W肌肉注射接种一次，共接种3次，每次免疫前及三免后2W、4W、6W分别断尾采血（三免2W后攻虫小鼠除外），分离血清。ELISA测定IgG、IgG1、IgG2a抗体水平；流式细胞术检测三免2W后每组5只BALB/c小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群变化；ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ、IL-4、TNF-α水平，以及血清中NO浓度。结果：
　　抗体水平：三免后,IgG OD410值 Prime-Boost免疫策略组显著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组（p<0.05）、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组（p<0.01）及PBS对照组（p<0.01）；IgG1浓度Prime-Boost免疫策略组与Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组比较，差异不显著（p>0.05），而与pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组及PBS对照组比较，差异显著（p<0.05）；IgG2a浓度Prime-Boost免疫策略组显著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组（p<0.05）、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组（p<0.01）及PBS对照组（p<0.01）。
　　T淋巴细胞亚群变化：三免2W后,CD4+ T细胞数量Prime-Boost免疫策略组与Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组比较，差异显著（p<0.05）,而与PBS对照组比较，差异极显著（p<0.01）；CD8+T细胞数量Prime-Boost免疫策略组与Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组比较，差异不显著（P>0.05）,与PBS对照组比较，差异显著（p<0.05）；CD4+/CD8+比值 Prime-Boost免疫策略组与Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组比较，差异显著（p<0.05），而与pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组及PBS对照组比较，差异极显著（p<0.01）。
　　细胞因子水平：三免后,IFN-γ浓度 Prime-Boost免疫策略组显著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组（p<0.05）、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组（p<0.01）及PBS对照组（p<0.01）；IL-4浓度Prime-Boost免疫策略组显著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组（p<0.05）、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组（p<0.05）及PBS对照组（p<0.01）；TNF-α浓度Prime-Boost免疫策略组与Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组比较，差异不显著（p>0.05），而与pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组及PBS对照组比较，差异显著（p<0.05）。
　　血清中 NO浓度：三免后,NO浓度 Prime-Boost免疫策略组略高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组，差异不显著（p>0.05），与pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组比较，差异显著（p<0.05）,与PBS对照组比较，差异极显著（p<0.01）。
　　5、NcSRS2-NcGRA7复合基因疫苗的免疫保护性评价
　　三免2W后，每个试验组各取10只BABL/c小鼠，每只腹腔攻击犬新孢子虫速殖子106个，攻虫后观察小鼠的临床症状并统计存活率；攻虫4W后，脱颈处死存活的BABL/c小鼠，病理解剖学观察各主要脏器的外观变化，病理组织学H.E染色和免疫组织化学观察脑组织、肝、脾等脏器的病理组织学变化及虫体定位，PCR方法检测脑组织、肝、脾等脏器中犬新孢子虫Nc-5基因。结果，攻虫4W后的BALB/c小鼠，Prime-Boost免疫策略组和Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组的存活率均为100%，未出现明显临床症状，主要器官组织均无明显病理变化和虫体存在，PCR检测各器官组织中犬新孢子虫Nc-5基因均为阴性；pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组的存活率为60%，攻虫后第7d出现精神沉郁、后肢麻痹等临床症状，主要器官组织以泛发型充血、出血为特征，脑、肝、脾组织中发现犬新孢子虫包囊或速殖子，PCR检测心、肝、脾、肺及脑组织中犬新孢子虫Nc-5基因阳性；而PBS对照组的存活率为20%，攻虫后第3d出现耸毛、怠惰、四肢瘫痪等临床症状，各器官组织以泛发型充血、出血为特征，脑、肝、脾组织中发现犬新孢子虫速殖子，PCR检测心、肝、脾、肺、肾及脑组织中犬新孢子虫Nc-5基因阳性。综合各试验组BALB/c小鼠免疫后产生的抗体、细胞因子等水平以及攻虫后的整体变化评价，四个试验组中Prime-Boost免疫策略组优势显著，该策略适用于新孢子虫病的防控。
　　结论：
　　1、应用SOE-PCR技术成功拼接了NcSRS2和NcGRA7基因，拼接复合基因的大小为1482 bp，并对NcSRS2-NcGRA7复合基因进行了克隆和生物信息学分析。
　　2、构建了重组真核表达质粒pVAX1-NcSRS2-NcGRA7，该质粒能够转染Vero细胞获得表达，并制备了pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗。
　　3、成功构建了滴度为109 TCID50/mL的Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒，并制备了Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗。
　　4、建立的Prime-Boost免疫策略与单疫苗比较，能够显著提高BALB/c小鼠的体液免疫水平和细胞免疫水平。
　　5、Prime-Boost免疫策略和Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗对攻虫4W后的BALB/c小鼠均有100%的免疫保护率。
　　6、综合攻虫前后BALB/c小鼠的整体变化评价，Prime-Boost免疫策略组显著优于其他各组，该策略有助于新孢子虫病的防控。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 犬新孢子虫及新孢子虫病

1.2 新孢子虫病诊断技术研究

1.3 宿主免疫应答与疫苗研究

1.4 腺病毒载体与Prime-Boost免疫策略研究

1.5 本研究目的与意义

第二章 牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7复合基因的克隆与生物信息学分析

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 本章小结

第三章 NcSRS2-NcGRA7复合基因核酸疫苗的构建

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 本章小结

第四章 NcSRS2-NcGRA7复合基因重组腺病毒疫苗的构建

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 本章小结

第五章 NcSRS2-NcGRA7复合基因疫苗的Prime-Boost免疫策略研究

5.1材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

5.4 本章小结

第六章 NcSRS2-NcGRA7复合基因疫苗的免疫保护性评价

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 讨论

6.4 本章小结

结论

参考文献

致谢

作者简介

攻读博士学位期间发表的学术论文